• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

РЕЗЮМЕ

Много биологични активности на изцяло транс-ретиноевата киселина (RA) се медиират от лиганд-активираните транскрипционни фактори, наречени рецептори на ретиноева киселина (RARs), но този хормон може също така да активира активирания ядрен рецептор пероксизомен пролиферационен рецептор β/δ (PPARβ/δ). Тук показваме, че диференциацията на адипоцитите е придружена от промяна в сигнализирането на RA, което при зрели адипоцити позволява на RA да активира както RARs, така и PPARβ/δ, като по този начин засилва липолизата и изчерпва липидните запаси. Проучвания in vivo, използващи индуциран от храната миши модел на затлъстяване, показват, че появата на затлъстяване се придружава от понижаване на регулирането на експресията и активността на мастния PPARβ/δ. RA лечението на затлъстели мишки индуцира експресия на PPARβ/δ и RAR целеви гени, участващи в регулирането на липидната хомеостаза, което води до загуба на тегло и подобрена реакция на инсулин. Лечението с RA също възстановява експресията на мастния PPARβ/δ. Данните показват, че потискането на затлъстяването и инсулиновата резистентност от RA се до голяма степен медиира от PPARβ/δ и се засилва допълнително чрез активиране на RARs. Като се насочва към два ядрени рецептора, RA може да бъде уникално ефикасен агент в терапията и профилактиката на метаболитния синдром.

транс-ретиноевата

Метаболитът на витамин А изцяло транс-ретиноева киселина (RA) регулира генната експресия чрез активиране на специфични членове на суперсемейството на транскрипционни фактори, известни като ядрени хормонални рецептори. Отдавна е установено, че много биологични дейности на RA се медиират от рецептори на ретиноева киселина (RARα, RARβ и RARγ) (7, 23). Неотдавнашните наблюдения обаче разкриха, че в допълнение към активирането на RARs, RA може да служи и като лиганд за активирания от пероксизома ядрен рецептор рецептор β/δ (PPARβ/δ) (32, 33, 37). Подобно на други ядрени рецептори от подклас 1, RARs и PPARβ/δ функционират като хетеродимери с ретиноидния X рецептор (RXR) и регулират транскрипцията чрез свързване към регулаторни региони на целеви гени, съдържащи елементи на отговор (RE), съставени от две директни повторения на мотива 5′-PuG (G/T) TCA. RXR-RAR хетеродимерите се свързват с RE, при което повторенията са на разстояние от 2 или 5 bp (DR-2, DR-5) (21). RE за хетеродимери RXR-PPAR се състоят от DR-1, съдържащ удължен 5'-половин участък, несъвършено ядро ​​DR1 и аденин като разстояния нуклеотид (8). Свързването на лиганд от тези хетеродимери води до активиране на рецептора и обикновено повишава скоростта на транскрипция на целевите гени.

Сред биологичните функции на PPARβ/δ от особен интерес е участието на този рецептор в регулирането на енергийния баланс. По отношение на това се съобщава, че репертоарът на директните цели за PPARβ/δ включва гени, участващи в метаболизма на липидите и глюкозата и че активирането на този рецептор увеличава липидния катаболизъм в скелетните мускули и мастната тъкан, предотвратява развитието на затлъстяване, подобрява инсулина чувствителност при предразположени към затлъстяване модели на мишки и повишава издръжливостта на упражненията (3, 6, 18, 26, 41, 42). Следователно се предполага, че PPARβ/δ агонистите могат да бъдат ефикасни агенти при лечението на метаболитния синдром (3). Наблюденията, че RA функционира като PPARβ/δ лиганд, пораждат интригуващата възможност този хормон да играе важна роля в регулирането на захарния и липидния метаболизъм и разположение. В допълнение към PPARβ/δ, класическите RARs също могат да участват в регулирането на липидната и енергийна хомеостаза. Например наличната информация предполага, че отделянето на протеин 1 (UCP1), протеин, който медиира разсейването на енергия, и аполипопротеин А1 (апо А1), който участва в плазмения транспорт на холестерол и други липиди, може да се регулира както от PPAR, така и от RAR ( 14, 30, 31).

По този начин ние се заехме да изследваме дали сигнализирането чрез PPARβ/δ и/или RARs е в основата на участието на RA в регулирането на енергийната хомеостаза. Използвайки култивирани адипоцити и модел на затлъстяване, индуциран от диета с високо съдържание на мазнини/високо съдържание на въглехидрати, ние показваме, че при зрелите адипоцити RA сигнализира както чрез RARs, така и чрез PPARβ/δ, за да индуцира експресията на множество гени, участващи в регулирането на енергийната хомеостаза и инсулинови отговори. По-нататък показваме, че прилагането на RA на затлъстели мишки води до загуба на мастна маса и подобрен глюкозен толеранс и че тези ефекти могат да бъдат проследени до активиране на PPARβ/δ и RARs в мастната тъкан, мускулите и черния дроб. Наблюденията показват, че поради способността си да активира два ядрени рецептора, RA е уникално ефективно средство за потискане на затлъстяването и инсулиновата резистентност.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Реактиви. Антитела срещу CRABP-II са предоставени от Cecile Rochette-Egly (13). Антителата срещу FABP5 са от R&D системи. Антителата към гликоген синтаза киназа 3β (GSK3β), фосфорилиран GSK3α/β, Akt1 и фосфорилиран Akt1 са от Cell Signaling. Антителата срещу RARα, RARβ и сукцинат дехидрогеназата (SDH) са от Santa Cruz Biotechnologies. Антителата срещу RARy, β-тубулин и PPARβ/δ са съответно от Affinity BioReagents, Sigma Aldrich и Abcam. Антитела срещу конюгирани пероксидаза срещу имуноглобулин от хрян срещу мишка и заек са от лаборатории Bio-Rad. Анти заешкият имуноглобулин G, конюгиран към Alexa Fluor, е от Invitrogen. RA е закупен от Calbiochem, RA пелетите са получени от Innovative Research of America. 4 - [(Е) -2- (5,6,7,8-тетрахидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил) -1-пропенил] бензоена киселина (TTNPB) и GW0742 са закупени от Biomol International и Toronto Research Diagnostics, Inc., съответно.

Биохимични анализи. Липолизата и натрупването на триглицериди се оценяват чрез използване на комплекти за натрупване на Zen Bio липолиза и триглицериди. Извършват се екстракции на клетки и тъкани и имуноблот анализи, както е описано по-горе (32). Денситометриите за имуноблоти се определят с помощта на програмата ImageJ (Национален здравен институт [NIH]). За количествен PCR анализ в реално време (Q-PCR), РНК се екстрахира с помощта на RNeasy мини кит (каталожен номер 74104), RNeasy липидна тъкан миникит (каталожен номер 74804) и RNeasy влакнест тъканен миникит (каталожен номер 74704) и cDNA се генерира чрез използване на GeneAmp RNA PCR (Applied Biosystems). Q-PCR се провежда чрез използване на TaqMan химия и анализи при поискване (Applied Biosystems) за CRABP-II (Mm00801691_m1), FABP5 (Mm00783731_s1), PPARβ/δ (Mm01305434_m1), свързан с мастната диференциация M1M ADR75; ), ANGPTL4 (Mm001278813_m1), Cyp26a (Mm00514486_m1) UCP1 (Mm00494069_m1), UCP3 (Mm00494074_m1), алдехид дехидрогеназа 9 (ALDH9; Mm00487200_m1) (Mm00436615_m1), RARα (Mm00436264_m1), RARβ (Mm01319680_m1), RARγ (Mm00441083_m1), хормоночувствителна липаза (HSL; Mm00495359_m1), hapo A1 (Hs00163641_m1 )_m1) m и ma. 18s rRNA (4352930E) беше използвана като контрола.

3T3-L1 клетъчна диференциация. 3T3-L1 фибробластите се отглеждат в модифицирана от Dulbecco среда Eagle (DMEM), допълнена с 10% телешки серум. Клетките се оставят да растат в продължение на 2 дни след сливането и се добавя диференцираща среда (DMEM, допълнена с 10% фетален говежди серум [FBS], 10 μg инсулин [Sigma Aldrich]/ml, 0,5 mM IBMX [3-изобутил-1- метилксантин; Sigma Aldrich] и 0,25 mM дексаметазон [ThermoFisher]). Три дни по-късно средата беше заменена с DMEM, допълнена с 10% FBS, и клетките бяха оставени да продължат да се диференцират още 4 дни. Диференциацията се определя чрез оцветяване с масло в червено и чрез проследяване на експресията на FABP-4.

Лентивируси, съдържащи shRNA. Ръка с къса фиби на мишка FABP5 (shRNA; TRCN0000011894) и мишка PPARβ/δ shRNA (TRCN0000026045) са получени от Open Biosystems и вирусите са произведени съгласно протокола на производителя. Вирусите се събират и клетките се заразяват два пъти с 24-часов интервал. Експериментите бяха проведени 5 дни по-късно.

Проучвания върху мишки бяха извършени от Центъра за метаболитно фенотипиране на мишки към университета Case Western Reserve. C57BL/6Ntac мишки (Taconic) бяха поставени на диета с високо съдържание на мазнини/захароза (HFHS изследователска диета D12331) в продължение на 16 седмици преди експериментиране. Слабите мишки бяха хранени с диу чау (LabDiet 5P76 облъчен Isopro RMH 3000 [Prolab, Сейнт Луис, МО]). Мишките бяха имплантирани подкожно с RA гранула или макет, гранулирани с помощта на прецизен трохар с 10 калибра (Innovative Research of America). Допълнителни експерименти с мишки бяха проведени с RA, GW0742 или TTNPB, разтворени в сусамово масло (Sigma Aldrich) и приложени чрез директно пипетиране (0,16 mg/50 μl) в устата на животните. Тъканите се събират след гладуване през нощта в края на експерименталната продължителност.

Тегло на тялото и прием на храна. Двадесет и четиричасовата консумация на храна се измерва веднъж седмично. През всеки 24-часов период мишките бяха настанявани индивидуално с тънък слой постелки и беше осигурено известно количество диети. Оставащата храна след 24 часа се претегля. Теглото на тялото е измерено преди и след 24-часовия период на хранене.

Изследван е тест за толерантност към глюкоза при мишки на гладно в продължение на 6 часа и инжектирани интраперитонеално с глюкоза (2 g/kg). Кръв се взема от пробната вена и на 0, 15, 30, 60 и 120 минути с помощта на UltraTouch метър.

Параметри на кръвта. След еднодневно гладуване мишките бяха убити и кръвта беше събрана чрез сърдечна пункция. Плазмата се изолира с помощта на епруветки за плазмен сепаратор Microtainer (Becton Dickinson). Инсулинът се измерва с помощта на свръхчувствителен анализ на ензим, свързан с инсулин на мишка (Mercodia, Lincoln Park, MO). Други параметри бяха измерени от ветеринарните диагностични служби (Marshfield Laboratories, Marshfield, WI).

Хистология. Тъканите бяха извлечени и консервирани в 10% формалин и след това обработени и разделени от ядрото на университета Case Western Reserve. Секциите бяха анализирани с помощта на Zeiss камера. Броят на чернодробните клетки се определя чрез преброяване на единични ядра на отделни клетки в × 10 поле от две секции на мишка; четири мишки бяха преброени от всяка група.

РЕЗУЛТАТИ

Адипогенезата е придружена от понижаване на регулирането на RAR и повишаване на сигнала за PPARβ/δ. За да изследваме механизмите, които са в основата на участието на RA в липидната хомеостаза, ние изследвахме сигналните пътища, по които хормонът функционира в адипоцитите. За тази цел се използва добре установеният модел на култивирани адипоцитни клетки NIH 3T3-L1. Преадипоцитните клетки се оставят да растат в продължение на 2 дни след сливането и се индуцират да се диференцират, като се използва стандартен хормонален микс (10 μg инсулин/ml, 0,5 тМ IBMX, 0,25 тМ дексаметазон). Три дни по-късно средата беше заменена с DMEM, допълнена с 10% FBS, и клетките бяха отглеждани в продължение на 4 дни. Диференциацията беше проверена чрез проследяване на натрупването на липиди и чрез изследване на индукцията на адипоцитния маркер FABP4 (вж. Фиг. S1a и b в допълнителния материал).

Ефекти на RA, GW0742 и TTNPB върху генната експресия при затлъстели мишки и в HepG2 клетки. (a и b) Нива на mRNA на целеви гени PPARβ/δ (a) и на PPARβ/δ и FABP5 (b) при нелекувани, лекувани с RA и третирани с GW0742 мишки след 3 седмици лечение (0.16 mg/ден) . *, P ≤ 0,05 (спрямо нелекувани мишки със затлъстяване). (c) Нива на мастна HSL и UCP1 и чернодробна апо A1 при затлъстели мишки, хранени със сусамово масло (затлъстели), RA, GW0742 или TTNPB за 2 дни (0,16 mg/ден). WATs и черен дроб бяха събрани, RNA беше изолирана и нивата на mRNA бяха изследвани чрез Q-PCR. *, P ≤ 0,05; **, Р = 0,09; ***, Р = 0,06 (спрямо нетретирани нетретирани мишки). (d) Нива на апо A1 mRNA в HepG2 клетки, третирани с обозначените лиганди (0.1 μM, 4 h). *, P ≤ 0,05 (спрямо нетретирани мишки).

Характеристики на затлъстели мишки, лекувани с RA и GW0742 в продължение на 3 седмици

ДИСКУСИЯ

Няколко реплики показват, че витамин А участва в регулирането на затлъстяването и енергийния баланс. Следователно беше съобщено, че прилагането на витамин А на мишки води до загуба на тегло (11), че генетичните манипулации на ензимите, които медиират метаболизма на витамин А при мишки, водят до промени в затлъстяването (45, 46) и че лечението на гризачи с витамин A или RA може да промени нивата на експресия на мастните гени, участващи в енергийната хомеостаза (11, 25). Въпреки това, молекулярните механизми, които стоят в основата на тези ефекти, остават не напълно разбрани.

Използвайки култивирани клетки и модел на затлъстяване, предизвикан от диета с високо съдържание на мазнини/високо съдържание на въглехидрати, ние демонстрираме, че RA предизвиква множество аспекти на програмата, за които е известно, че се задействат при активиране на PPARβ/δ. В адипоцитите RA индуцира експресията на целеви гени PPARβ/δ, включително гени, участващи в липидния метаболизъм - напр. Гени, кодиращи разединяващи протеини, ALDH9, необходим за окисляване на мастните киселини, и ANGPTL4, адипокин, който регулира метаболизма на липопротеините в плазмата (20) - и гени, кодиращи протеини като PDK1 и GLUT4, които участват в инсулиновите отговори. In vivo, лечението с RA регулира експресията на преработващи липиди и захар PPARβ/δ целеви гени в мастната тъкан и черния дроб и рекапитулира докладваната активност на PPARβ/δ при увеличаване на митохондриалното съдържание на скелетните мускули (42). Забележително е, че лечението с RA на затлъстели мишки е довело до загуба на тегло и до подобрен глюкозен толеранс въпреки по-големия прием на храна на лекуваните мишки. Взети заедно, с по-високата телесна температура на третирани с RA мишки, тези наблюдения показват, че загубата на тегло произтича от засилено използване на енергията.

Резултатите от настоящото проучване показват, че лечението с RA на затлъстели мишки води до изчерпване на мастните запаси от липиди, индукция на загуба на тегло, обръщане на чернодробната стеатоза, увеличаване на съдържанието на мускулни митохондрии, подобряване на глюкозния толеранс и реактивиране на FABP5/PPARβ/δ пътека. Тези данни осигуряват обосновка на отдавна забелязаната, но слабо разбрана функция на витамин А при регулирането на енергийния баланс и предполагат, че RA може да бъде ефикасно средство за потискане на затлъстяването и инсулиновата резистентност.

ПРИЗНАВАНИЯ

Това проучване беше подкрепено от гранта на NIH R01 DK060684 и от гранта ADVANCE 024505 за програмата ACES на университета Case Western Reserve. Центърът за метаболитно фенотипиране на мишки на университета Case Western Reserve се поддържа от гранта на NIH DK59630.