Макс М. Вила

катедра по молекулярна генетика и микробиология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

диетичния

b Център за геномна и компютърна биология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

Рейчъл Дж. Блум

b Център за геномна и компютърна биология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

c Университетска програма по генетика и геномика, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

Джъстин Д. Силвърман

e Колеж по информационни науки и технологии, Penn State University, University Park, Pennsylvania, USA

h Катедра по медицина, Penn State University, Hershey, Pennsylvania, USA

Хедър К. Дюран

катедра по молекулярна генетика и микробиология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

b Център за геномна и компютърна биология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

Шарън Дзян

катедра по молекулярна генетика и микробиология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

b Център за геномна и компютърна биология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

Анчи Ву

f Катедра по биомедицинско инженерство, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

Ерик П. Далоу

катедра по молекулярна генетика и микробиология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

b Център за геномна и компютърна биология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

Shuqiang Huang

g Шенженски институт по синтетична биология, Шенженски институти за модерни технологии, Китайска академия на науките, Шенжен, Китайска народна република

Lingchong You

b Център за геномна и компютърна биология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

f Катедра по биомедицинско инженерство, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

Лорънс А. Дейвид

отдел по молекулярна генетика и микробиология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

b Център за геномна и компютърна биология, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

c Университетска програма по генетика и геномика, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

d Програма по компютърна биология и биоинформатика, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

f Катедра по биомедицинско инженерство, Университет Дюк, Дърам, Северна Каролина, САЩ

Свързани данни

Подвижност на бактериите във водни капчици в масло. За да се подобри изобразяването и да се изравнят капчиците във фокалната равнина, се оставя мастният слой, отделящ водни капчици, да се изпари частично. Това изпаряване води до капчици, които приемат шестоъгълна форма. Изтеглете Video S1, AVI файл, 10,1 MB.

Резултати от растежа с антибиотици в капчици (A) и 96-ямкови плаки (B), като се използват четири чревни изолати (Bacteroides spp. 1, Bacteroides spp. 2, Bacteroides thetaiotaomicron и Enterobacter cloacae), отглеждани в mGAM и шест различни антибиотични комбинации ( амоксицилин [100 μg/ml] [amox], амоксицилин плюс клавуланат [100 μg/ml] [amoxclav], ампицилин [100 μg/ml] [amp], гентамицин [10 μg/ml] [gent], канамицин [50 μg/ml] [kan] и ципрофлоксацин [5 μg/ml] [cipro]). Растежът се измерва чрез qPCR и секвениране (капчици) и OD600 (96-ямкови плаки) след 24 часа. (C) Кривата на работната характеристика на приемника (ROC) на анализа MicDrop води до различни гранични стойности на прага на растеж, като се използват данните, показани в панел Б като референция. Стойността на границата на растежа на удвояване от най-малко 2,14 × [Δ ln (изобилие на SV ДНК) ≥ 1,48] максимизира истински положителната скорост, като същевременно минимизира фалшиво положителната скорост (Йуден J; максималната стойност, обозначена със звезда на кривата) и беше използвана за изчертаване на топлинната карта, представена в панел А. Изтеглете FIG S2, TIF файл, 2.1 MB.

Всички SV, открити в експеримента на MicDrop, като се използва проба от човешко изпражнение. Модифицираните криви на растеж на Gompertz се приспособяват към времеви редове. SV се оцветяват с таксономия и се сортират според общия растеж (височина на асимптотата на кривата, обозначена с главна гръцка делта [Δ]), която е обозначена на всеки участък. За да се улесни прегледът, кривите се изместват вертикално, така че y пресичанията да са в началото. Изтеглете FIG S3, TIF файл, 1,7 MB.

Сравнение между културен инокулат от същия замразен запас. (А) Клетките бяха съживени от замразени фекални суспензии в богата среда (mGAM) за една нощ, за да позволят на клетките да се възстановят от замръзване. След това излишните хранителни вещества бяха изчерпани чрез повторно култивиране на бактерии за една нощ в минимална среда, съдържаща глюкоза и галактоза като единствени източници на въглерод. След определяне на концентрацията на зареждане, бактериите след това се измиват и разреждат преди капсулиране. (Б) Възпроизводимост на инокулатния състав след съживяване от идентични замразени източници. Изтеглете FIG S4, TIF файл, 0,9 MB.

(А) Изследване на това кои комбинации от пребиотици са наблюдавани все по-малко случайно. Знаците плюс и минус в долната част на графиката показват броя на таксоните, наблюдавани за дадена комбинация, които са били статистически повече и по-малко вероятно да се появят при гранична стойност (P Това съдържание се разпространява при условията на лиценза Creative Commons Attribution 4.0 International.

16S rRNA последователност на метаданни и дълбочина на четене. Изтеглете Таблица S1, XLSX файл, 0,02 MB.

Чувствителност на напасването на кривата към границите на параметрите. Данните по оста x показват всеки параметър за напасване, както е дефиниран от границите, описани в Материали и методи. Данните по оста y отразяват параметрите за напасване с алтернативни граници на параметрите. Всяка точка представлява подходящи параметри за отделни SV. Изтеглете FIG S6, TIF файл, 1,9 MB.

Таблица на средната формулировка и източниците на въглерод, използвани за пребиотичния анализ. Изтеглете таблица S2, файл XLSX, 0,01 MB.

Списък на бактериалните щамове, използвани в това проучване. Изтеглете таблица S3, файл XLSX, 0,01 MB.

Генерираните в това проучване 16S рРНК нуклеотидни последователности са предоставени в Европейския нуклеотиден архив под номер за присъединяване на проучването PRJEB33065.

РЕЗЮМЕ

ВАЖНОСТ Бактериалната култура и анализ са компоненти на основните микробиологични изследвания, разработване на лекарства и диагностичен скрининг. Разнообразието на общността обаче може да направи предизвикателство да се извършват цялостно експерименти, включващи отделни членове на микробиота. Тук представяме нова микрофлуидна културна платформа, която прави възможно измерването на растежа и функцията на съставките на микробиотата в един набор от експерименти. Като доказателство за концепцията, ние демонстрираме как платформата може да се използва за измерване на това как стотици бактериални таксони на червата, взети от различни хора, метаболизират диетичните въглехидрати. Занапред очакваме тази микрофлуидна техника да бъде адаптирана към редица други нужди от микробен анализ.

ВЪВЕДЕНИЕ

Базираните на култура анализи могат да разкрият важни функционални разлики между чревните микробни общности на индивидите. Такива различия често не са очевидни от проучвания за секвениране на 16S рРНК, които не разрешават бактериалната таксономия под нивото на вида (1). Културно-базирани проучвания са способни да разрешат функционалните вариации на ниво щам, които могат да доведат до индивидуални вариации в свързаните с микробиома здравето и резултатите от заболяването. Например, селективни анализи за растеж, отдавна се използват за идентифициране на индивиди, приютяващи патогенни щамове на микробни таксони на коменсалните черва (2). Тестовете за инхибиране също са използвани за разкриване на вариации на щама в рамките на бактериални видове, които определят дали микробиотата на индивидите може да устои на патогени (3), а екраните за използване на въглерод показват, че щамовете от един и същи бактериален вид, изолирани от различни хора, могат да се различават по способността си да метаболизират диетични въглехидрати (4, –6).

Тук разработихме платформа за отделяне, култивиране и изследване на бактерии от човешката чревна микробиота на капчици (MicDrop), използвайки достъпни техники и оборудване. Ключово предизвикателство, с което се занимава нашият метод, е измерването на растежа на изолатите в отделни микрофлуидни капчици. За да постигнем това, ние разчитаме на 16S рРНК гени като вътрешни ДНК баркодове, които се споделят между капчици, носещи едни и същи бактериални таксони. Този подход от своя страна ни позволява да измерваме растежа на таксоните в капчици, без да е необходимо използването на техники на двойна емулсия или сортиране на капчици. Вместо това, ние комбинираме едноемулсионни (вода в масло) протоци за микрофлуидни капчици с молекулярни техники (количествена PCR [qPCR] и 16S rRNA генно секвениране). Тези опростени протоколи ни позволяват да използваме готови микрофлуидни помпи и чипове, които са достатъчно компактни, за да се поберат в типичните анаеробни камери.

За да демонстрираме полезността на MicDrop за измерване на функционални разлики между проби от човешка микробиота на ниво отделни бактериални таксони, ние приложихме платформата, за да отговорим на изключителен въпрос в изследванията на микробиологията на червата: различават ли се индивидите по броя на чревните бактериални видове, които могат да разграждат комплекса диетични въглехидрати? Използвайки MicDrop, ние характеризираме диетичния метаболизъм на полизахариди сред стотици чревни бактериални видове от девет различни хора. Установихме, че всички индивиди притежават микроби, които могат да разграждат изследваните въглехидрати, и въпреки това нивата на бактериите, разграждащи въглехидратите, се различават между индивидите. Бактериалните таксони на червата също могат да бъдат категоризирани в широка степен по това дали са израснали върху единични или множество полизахариди. Заедно тези данни предполагат рационални подходи за пребиотичен дизайн и демонстрират потенциала на микрофлуидни анализи за капчици за сравнение на темповете на растеж и функциите на отделните бактериални щамове в сложни микробни съобщества.

РЕЗУЛТАТИ

MicDrop: платформа за култивиране на човешка чревна микробиота на капчици.

ФИГ. S1