Двуизмерно имунофлуоресцентно оцветяване на изолирани сателитни клетки от говежди мускули (BSC). (А) Размножаващ се говежди сателит, оцветен за DAPI, актинов цитоскелет (Phalloidin) и Pax7, ядрен маркер на сателитни клетки. Петната показват много чиста популация на сателитни клетки, следвайки протокола за изолиране и предварително покритие. (B) След една седмица на диференциация, клетките бяха оцветени за DAPI, актинов цитоскелет (Phalloidin) и Troponin T (CT3), маркер на миогенезата. Скалите са 200 µm.

безплатни

Разпространение на BSC, отглеждани в присъствието на различни концентрации на Hb или Mb в 2D. (А) Клетъчен брой на BSC, BSC + 3 mg/mL Hb или BSC + 3 mg/mL Mb, количествено измерен с реагент CyQuant (n = 6) след един, три, пет и седем дни. Наблюдава се пролиферация на BSC с различни концентрации на (B) Hb и (C) Mb, при 1, 3 или 5 mg/ml (n = 6). Броят на клетките се изчислява от стандартна крива, приготвена от клетки, засети с известна плътност. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001.

Свойства на образуването на скелетна мускулна тъкан. (А) Представителни изображения на биоизкуствени мускули (BAMs), генерирани от BSCs, BSCs + Hb и BSCs + Mb (3 mg/ml за двата хем протеина) в различни времеви точки (един, четири, седем и девет дни инкубация), показващ увеличена интензивност на цветовете в конструкции с Hb и Mb. Скалата е 10 мм. (B) Представени са теглото, ширината и дебелината на BAM в момента на прибиране на реколтата. Групите бяха сравнени с групи без добавен ACA (–ACA) и фибринов гел без добавени клетки, и двете инкубирани за еднакво време, при същите условия, за сравнение на уплътняването на хидрогел от клетките. Широчината и дебелината могат да бъдат измерени само в + ACA BAMs, тъй като –ACA BAM се откъсват от опорни точки и губят физическата си форма. (C) ДНК на BSCs, BSCs + Mb (n = 5) и BSCs + Hb (n = 4) беше извлечена чрез разграждане на протеиназа К и абсорбцията беше измерена с NanoDrop.

Конфокално имунофлуоресцентно изображение на BAM. BAM, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/ml и за двата хем протеина), бяха оцветени след осемдневна диференциация за DAPI, актинов цитоскелет (фалоидин) и тропонин Т (CT3), маркер на миогенезата . Изображенията показват многоядрено образуване на миотръби в BSC и BSC + Mb конструкции, макар и не в BSC + Hb конструкции. Скалите са 200 µm.

Живо мъртво оцветяване на мускулни конструкции. BAM, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/ml за двата хем протеина), бяха оцветени с калцеин АМ (живи клетки, зелено) и етидиев хомодимер (мъртви клетки, червено), за да се наблюдава цялостната жизнеспособност на клетките. Изображенията са направени в зелен канал (488 nm) и червен канал (594 nm), при идентични условия на микроскоп, с z-Stack. За визуализиране на цялостната жизнеспособност на клетките в цялостната конструкция е извършено x-y-шевове. Мащабната лента в едноканални изображения е 200 µm, а мащабната лента в общата конструкция е 1000 µm.

Подравняване на BSC. (A) BAM, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/ml за двата хем протеина), бяха оцветени с калцеин АМ и изобразени с флуоресцентен микроскоп, след което изображенията бяха обработени на Фиджи с инструмента за насочване ( Метод на Фурие). Изравняването на клетките беше определено като процент на структурите, които бяха подравнени между -10 ° и 10 ° по отношение на оста на подравняване (0 °). Статистическата значимост беше определена чрез еднопосочен ANOVA и множество сравнения post hoc на Tukey (α = 0,05). Лентите за грешки са стандартни отклонения (n = 9). (B) Средната ориентация на миотръбите на контролната група (BSC) е визуализирана чрез представителен график за роза MatLab. *** p ≤ 0,001.

Сканиращи изображения с електронна микроскопия на BAM. BAM, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/mL за двата хем протеина), бяха дехидратирани и разпръскване покрито със злато. Снимките са направени в увеличение 1000 × (скала = 50 µm) в центъра на тъканта и 2000 × увеличение (скала = 100 µm) от страната на тъканта.

Биохимичен анализ на секретирани протеини чрез BAMs. Средата за клетъчни култури от BAM, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/ml за двата хем протеина), се отстранява след 72 часа инкубация и се измерва за (A) азотен оксид (n = 5) и (B ) Съдържание на разтворими GAG (n = 6). * p ≤ 0,05.

Съдържание на пигмент и оцветяване на тъканите. (А) Общото съдържание на пигмент се определя количествено спектроскопски чрез хомогенизиране на BAMs, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/ml за двата хем протеина) и говеждо месо (n = 6 за всички групи) в натриев фосфатен буфер, което води до освобождаване на пигмент в разтвора. Количеството пигмент се изчислява от стандарт на Hb и Mb. (B) Показват се средни стойности на L * a * b * за BSC (n = 6), BSC + Hb (n = 5) и BSC + Mb (n = 6) и говеждо месо (n = 9). Говеждият цвят се представя като пресен или варен BAM цвят след инкубация от един ден или девет дни. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001.

Резюме

1. Въведение

2. Материали и методи

2.1. Изолация на сателитни клетки от говеда и клетъчна култура