Транслационна фармакология

Тази статия е част от изследователската тема

Метаболомика, фармакометабономика и фармакология Вижте всички 8 статии

Редактиран от
Houkai Li

Шанхайски университет по традиционна китайска медицина, Китай

Прегледан от
Джинджун Шан

Университет по китайска медицина в Нанкин, Китай

Ke Lan

Университет Съчуан, Китай

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

метаболизма

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Училище по фармация, Шанхайски университет Jiao Tong, Шанхай, Китай
  • 2 Шанхайска ключова лаборатория за захарен диабет и Център за транслационна медицина, Шанхай Jiao Tong, асоциирана шеста болница за хора, Шанхай, Китай
  • 3 Център за рак на Университета в Хавай, Хонолулу, HI, САЩ

Въведение

Затлъстяването, като ключов компонент на метаболитния синдром, е тясно свързано с риска от развитие на сърдечно-съдови заболявания, диабет тип 2 и дори много видове рак (Kolotkin et al., 2001; Ogden et al., 2014). Съществуват редица възможни патофизиологични механизми, участващи в развитието и поддържането на затлъстяването. Предишни проучвания предполагат, че затлъстяването е силно корелирано с FFA, които се получават от адипоцити чрез липолиза (Boden and Shulman, 2002; Boden, 2011). Наскоро нашата група съобщи за няколко плазмени FFA като надеждни маркери при прогнозиране на бъдещите метаболитни аномалии при затлъстели лица, като дихомо-гама-линоленова киселина (DGLA), съотношение стеаринова киселина/палмитинова киселина (SA/PA), олеинова киселина/стеаринова съотношения на киселина (OA/SA) и арахидонова киселина/дихомо-γ-линоленова киселина (AA/DGLA) (Ni et al., 2015; Zhao et al., 2016, 2017).

Puerh чай, ферментирал черен чай, направен от млади листа от Camellia sinensis, е добре известен със своя уникален аромат и вкус. Натрупващите се доказателства показват, че Puerh чай може да намали телесното тегло, да потисне хиперлипидемията, да понижи нивата на триглицеридите, общия холестерол и нивата на липопротеин-холестерол с ниска плътност и да повиши нивата на липопротеините с висока плътност (Chu et al., 2011; Qiong и Xishuang, 2014; Cai et al., 2017). Въпреки това, специфичният ефект на Puerh чай върху метаболизма на FA е изследван и ние подозираме, че има механистична връзка между FA метаболизма и ефекта на затлъстяване на Puerh чай. По този начин проведохме това проучване, за да изследваме анти-затлъстяването и хиполипидемичния ефект на Puerh чай в модел на затлъстели мишки, индуциран от диета с високо съдържание на мазнини (HFD).

Съществуват разнообразни продукти от чай Pu-erh, произведени с различни процеси на ферментация и/или чаени листа, събрани от различни места за насаждение. Фитохимичните компоненти могат да се различават значително при различните продукти/партиди чай Pu-erh. В това проучване ние избрахме продукт от незабавен чай Puerh, произведен с помощта на добре установен, стандартизиран процес на ферментация и екстракция, за да поддържаме постоянни химични съставки сред различните партиди чай Puerh и да постигнем възпроизводими резултати. Моменталният Puerh чай, използван в нашето проучване, съдържа повечето компоненти в зрелия Puerh чай и е по-хомогенен при контролиране на дозировката на чаената запарка, въз основа на предишната ни оценка на Puerh чай продукти.

Материали и методи

Химикали и реактиви

Контролната диета съдържа 10% липиди, 19% протеини и 71% въглехидрати, докато HFD съдържа 45% липиди, 19% протеини и 36% въглехидрати (Trophic Animal Feed High-tech Co. Ltd., Nantong, China). Настойките за чай Pu-erh бяха приготвени чрез разтваряне на 600 mg от Puerh чай на прах (търговски продукт, Deepure, придобит от Tasly Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin, China) с 200 ml чиста стерилизирана вода. Общо 54 FFA стандарта са получени от Sigma-Aldrich, TRIzol Reagent (Invitrogen, Life Technology, САЩ), Prime Script RT Reagent Kit (TAKARA, Kusatsu, Япония) и Power Up SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, САЩ). Чаеният прах се екстрахира съответно с вода и метанол и доминиращите съединения в моменталния Puerh чай се анализират чрез UPLC-QTOF-MS (допълнителна фигура 1 и допълнителна таблица 1). Доминиращите съединения включват L-аргинин, епикатехин галат, галокатехин галат, мирицетин, кофеин и теофилин, идентифицирани в режим на положителен йон и галова киселина, катехин, епакатехин, галокатехин, епигалокатехин, катехинов галат, кемпферол, кверцетин 3, кверцетин-О-Glu и Kaempferol-3-О-Glu се идентифицира в режим на отрицателни йони.

Изследване на животни и вземане на проби

Това проучване е проведено в съответствие с препоръките на националното законодателство и местните насоки на Центъра за лабораторни животни към Шанхайската болница за шести хора в Шанхай Jiao Tong, Шанхай, Китай. Протоколът беше разгледан и одобрен от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните към Центъра за лабораторни животни, болница Шести народен университет в Шанхай Jiao Tong, Шанхай, Китай.

C57BL/6J мишки (мъжки, на 3 седмици) са закупени от Shanghai Laboratory Animal Co. Ltd. (SLAC, Shanghai, China). Всички мишки бяха поддържани в среда без специфичен патоген (SPF) с контролирани условия на 12-часов цикъл светлина/тъмнина при 20–22 ° C и влажност 45 ± 5%. Мишките се аклиматизират на контролна чау диета ad libitum за 1 седмица и след това на случаен принцип се разделя на три групи: контролната група получава нормална чау (контролна диета), HFD и HFD с инфузионна група Pu-erh в доза от 450 mg/Kg на ден (HFD + Pu-erh чай) . Настойките от чай Pu-erh се приготвят за концентрация 3 mg/ml чрез разтваряне на 600 mg чай на прах с 200 ml чиста стерилизирана вода. Всички мишки бяха отгледани със свободен достъп за контрол на чау/HFD и инфузия вода/чай и телесното им тегло се записва веднъж седмично в продължение на 22 седмици. В края на тези експерименти мишките са гладували цяла нощ, преди да бъдат евтаназирани. Кръвните проби се събират и след това се съхраняват при стайна температура в продължение на половин час преди центрофугиране при 4 ° С, 5000 об/мин за 10 минути, за да се получат серумните проби. Тъкани, включително черен дроб, коремна мастна тъкан, периренална мазнина и подкожна мазнина бяха внимателно събрани, държани в течен азот и след това съхранявани при -80 ° C до анализ.

Подготовка на проби и анализ на FFA

FFA в серумните и чернодробните тъкани бяха извлечени и количествено определени, както е описано по-рано (Zheng et al., 2016). Накратко, пробите бяха претеглени и екстрахирани със смес от изопропанол и хексан, съдържаща фосфат чрез хомогенизиране и центрофугиране. Супернатантата се смесва с вътрешен стандарт (нонадецилова киселина-D37) и впоследствие се екстрахира с хексан и вода. След това сместа беше прехвърлена в нова епруветка и изсушена с вакуум и по-нататък разтворена с метанол за инструментален анализ с UPLC-QTOF-MS (Waters Corp., Milford, MA, САЩ).

Инструменталните параметри на анализа бяха определени, както следва. Подвижната фаза бяха вода (A) и ацетонитрил/изопропанол (v/v = 80/20, B). Използва се хроматографска колона BEH C18 (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm) за разделяне на съединението със скорост на потока 0,4 ml/min и температура на колоната при 40 ° C. Градиентът на елуиране е 70% В (0–2 минути), 70–75% В (2–5 минути), 75–80% В (5–10 минути), 80–90% В (10–13 минути), 90–99% В (13–16 минути) и се поддържа при 99% В в продължение на 5 минути, преди да се върне към първоначалното състояние. MS работи в режим на отрицателен електроспрей с капилярно напрежение 2.5 kV, конус за вземане на проби при 55 V, конус за екстракция при 4 V, температура на източника при 150 ° C и температура на разтваряне при 450 ° C. Стандартният калибриращ разтвор с 54 FFA стандарти при 11 различни нива на концентрация беше анализиран за изграждане на калибрационната крива. Анотирането и количественото определяне са извършени от TargetLynx мениджър на приложения (Waters Corp., Милфорд, Масачузетс, САЩ).

Хистологично оцветяване на чернодробна секция

Чернодробните тъкани бяха фиксирани в 10% неутрално буфериран формалин, вградени в парафинови блокове и обработени за рутинно H&E оцветяване. Впоследствие оцветените секции бяха изследвани за хистопатологични промени.

Измерване на биохимични параметри и чернодробни липиди

Серумните TC, TG, HDL и LDL бяха измерени с помощта на автоматичен биохимичен анализатор TBA-40FR (TOSHIBA, Япония), съгласно протокола на производителя. Чернодробните липиди се екстрахират по метода на Folch. Накратко, чернодробните тъкани се хомогенизират с разтвор на хлороформ/метанол (2/1, v/v) до краен обем, 20 пъти по-голям от този на тъканната проба и последвани от поредица от етапи на дисперсия, разбъркване и центрофугиране. Общият чернодробен холестерол (TC) и триглицеридите (TG) бяха измерени с помощта на комплекти Elisa (BluGene Biotech, Шанхай, Китай) в съответствие с инструкциите на производителя.

Тест за орална толерантност към глюкоза (OGTT) и тест за толерантност към инсулин (ITT)

OGTT и ITT се извършват съответно след 12 и 4 часа гладуване. Около 1 g/Kg глюкоза се дава чрез орален сонда за OGTT тест, а 0,75 единици/Kg инсулин се дава чрез интраперитонеална инжекция. Кръвни проби на 0, 15, 30, 60 и 120 минути бяха събрани от опашната вена. Измерват се нивата на кръвната глюкоза и се изчислява площта под кривата (AUC) по време на OGTT и ITT теста.

Количествена PCR в реално време

Чернодробните тъкани се хомогенизират и общата РНК се изолира, използвайки TRIzol Reagent. Общата концентрация на РНК се измерва с помощта на спектрофотометър NanoDrop 2000C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САЩ). Общата РНК се транскрибира обратно, като се използват произволни хексамерни праймери, за да се образуват сДНК шаблони, използващи Prime Script RT Reagent Kit. Количествената PCR реакционна смес в реално време се създава с помощта на Power Up SYBR Green PCR Master Mix и реакцията се провежда в PCI система за реално време ABI 7900HT (Applied Biosystems Instruments, Thermo Fisher Scientific, САЩ). Всички процедури бяха извършени в съответствие с инструкциите на производителя. GAPDH се използва като домакински ген и относителната експресия на целевите гени се изчислява, използвайки сравнителния подход Ct (dCT) и в крайна сметка относителната експресия се използва като кратни промени спрямо контролната група.

Статистически анализ

Получени са сурови данни от количественото определяне на FFA с MassLynx v4.1 и анализирани от TargetLynx v4.1 (Waters, Milford, MA, САЩ). Всички диаграми на бара в това проучване са генерирани с GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ) и диференциален анализ с Mann-Whitney U тестът беше проведен с помощта на SPSS 20.0 (IBM SPSS, САЩ) със значими критерии, определени за * стр-стойност ∗ стр ∗ стр ∗ стр ∗ стр ∗ стр Ключови думи: Pu-erh чай, свободни мастни киселини, понижаващ липидите ефект, бета-окисляване на мастни киселини, затлъстяване

Цитиране: Huang F, Wang S, Zhao A, Zheng X, Zhang Y, Lei S, Ge K, Qu C, Zhao Q, Yan C и Jia W (2019) Puerh Tea регулира метаболизма на мастните киселини при мишки с високо Диета с мазнини. Отпред. Pharmacol. 10:63. doi: 10.3389/fphar.2019.00063

Получено: 28 ноември 2018 г .; Приет: 18 януари 2019 г .;
Публикувано: 05 февруари 2019 г.

Houkai Li, Шанхайски университет по традиционна китайска медицина, Китай

Ke Lan, Университет Съчуан, Китай
Jinjun Shan, Университет по китайска медицина в Нанкин, Китай