Информация за статия

* Първите двама автори са допринесли еднакво.

xiaotan

Pinkang Wei, Катедра по традиционна китайска медицина, болница Changzheng, Военноморски медицински университет (Втори военномедицински университет), No. 415 Fengyang Road, Шанхай 200003, Китай. Имейл: [имейл защитен]

Резюме

Обективен

Това проучване е проведено, за да се оцени влиянието на затлъстяването върху колоректалния рак (CRC) и да се изследва ефикасността на отварата Xiaotan Tongfu (XTTF) за лечение на CRC.

Методи

Мишките BALB/C бяха използвани за установяване на CRC модел, свързан със затлъстяването, чрез диета с високо съдържание на мазнини и имплантация на тумор. Туморите са събрани от мишки, инокулирани със CT26 клетъчна суспензия. Наблюдавани са телесно тегло, чернодробно тегло, чернодробни метастази и хистологични промени. Извършен е имунохистохимичен анализ и полимеразна верижна реакция в реално време за измерване нивата на инсулиноподобен растежен фактор 1 (IGF-1), IGF-1 рецептор (IGF-1R) и IGF свързващ протеин 3 (IGFBP-3).

Резултати

Затлъстяването повлиява секрецията на IGF и влошената CRC, докато отварата от XTTF инхибира процеса на чернодробни метастази в CRC, като регулира секрецията на IGF-1/IGF-1R и понижава регулирането на секрецията на IGFBP-3.

Заключения

Това проучване предоставя доказателства, че отварата от XTTF може да служи като лечебно средство за лечение на CRC.

Въведение

Колоректалният рак (КРР) е третият най-често диагностициран рак при мъжете и вторият при жените и има лоша прогноза с висока смъртност. 1 Високите нива на CRC в „западните“ страни показват, че околната среда или начинът на живот, особено приемът на високоенергийни храни и липсата на физически упражнения, могат да играят жизненоважна роля в етиологията на CRC.

Събирането на епидемиологични доказателства постоянно показва положителна връзка между затлъстяването и КРС; екологичните данни показват високи нива на CRC в страни с високо разпространение на затлъстяването. 2 Въпреки че има убедителни доказателства, свързващи затлъстяването с риска от CRC, основните биологични механизми все още не са напълно изяснени. 3 Повечето от сигналните пътища, свързани с процеса на прогресия на тумора, се фокусират върху транскрипционни фактори, които фундаментално коригират експресията на гени, участващи в стимулацията на възпалението, ангиогенезата и туморните метастази. 4 Инсулиновата резистентност, адипокините и хроничното възпаление, предизвикано от затлъстяване, могат да играят ключова роля в сложните метаболитни пътища на колоректалната канцерогенеза. 2 Подкрепящи доказателства показват, че инсулиноподобният растежен фактор 1 (IGF-1) е свързан с CRC и по-високите нива на IGF-1 са свързани с повишен риск от CRC. 5 Хирургията, химиотерапията и лъчетерапията в момента са основите на CRC терапията; обаче неблагоприятните ефекти на тези терапии не могат да бъдат пренебрегнати. Поради това са необходими нови или допълнителни по-безопасни методи на лечение.

Традиционната китайска медицина (TCM) е широко използвана и се е доказала като ефективна при лечението на КРС. 6,7 Въз основа на проучвания на различни видове TCM, ние приготвихме отвара Xiaotan Tongfu (XTTF), която има сложен състав и упражнява функции главно чрез Pinelliae rhizoma, Citrus reticulata Blanco, и Пория, като ефективен подход при лечението на КРС. Предишни проучвания предполагат това Pinelliae rhizoma очевидно инхибира растежа на рак на яйчниците SKOV3 клетки. 8 Nobiletin, активно съединение на Citrus reticulata Blanco, е потвърдено, че потиска разпространението и инвазията на няколко вида клетки на дебелото черво. 9 Пахимична киселина от Пория има значителна противоракова активност в клетъчната култура и може да инициира апоптоза в раковите клетки на простатата чрез митохондриална дисфункция. 10 Въз основа на тези констатации предположихме, че отварата XTTF може да се прилага за управлението на CRC.

В това проучване предположихме, че затлъстяването има положително влияние върху CRC, докато отварата от XTTF може ефективно да облекчи CRC, като пречи на чернодробните метастази. Смятахме, че неговият механизъм на действие може да включва IGFs като IGF-1, IGF-1 рецептор (IGF-1R) и IGF свързващ протеин 3 (IGFBP-3). XTTF отварата може да бъде полезна при лечението на CRC.

Методи

Материали

Компонентите на отварата XTTF са закупени от Shanghai Ley’s Pharmaceutical Co., Ltd. (Шанхай, Китай), а отварата е произведена в болница Changzheng. Антитела срещу IGF-1, IGF-1R и IGFBP-3 са получени от Abcam (Кеймбридж, Великобритания). Тризол реагент и реактив за транскрипция са получени от JRDUN Biotechnology Company (Шанхай, Китай).

Клетъчна култура

CT26 клетки на рак на дебелото черво на мишка са закупени от Центъра за клетки на Шанхай, Китайската академия на науките (Шанхай, Китай). Клетките се култивират в среда RPMI-1640 (GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), съдържаща 25% фетален телешки серум (Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd., Hangzhou, China) и се инкубират при 37 ° C в атмосфера от 5% въглероден диоксид.

Животни

Мъжки мишки BALB/C на възраст от 6 до 8 седмици и с тегло 18 до 20 g са закупени от Експерименталния център за животни към Китайската академия на науките (Шанхай, Китай). Мишките бяха държани в съоръжение за животни без патогени в продължение на 1 седмица преди експеримента. Всички експерименти са проведени в съответствие с насоките за грижи и използване на лабораторни животни. Всички извършени експериментални операции са одобрени от Институционалния съвет за преглед на Шанхай SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.

Създаване на модел на чернодробни метастази на CRC с високо съдържание на мазнини при мишки

За да оптимизираме констатациите си за свързаната със затлъстяването CRC в това проучване, ние разделихме експериментите с животни на две части.

Част 1: Мишките бяха разделени на случаен принцип в две диетични групи (n = 20 всяка): тези, хранени с редовна диета и тези, хранени с високо съдържание на мазнини. Дванадесет седмици след началото на храненето, мишките бяха подкожно инокулирани с общо 1,0 × 108 CT26 клетки в дясната им аксила, за да развият имплантационни тумори. След това се събира хистологично непокътната туморна тъкан и се имплантира в стената на дебелото черво на мишки, за да се установи модел, подобен на човешки CRC. Всички мишки бяха разделени на четири групи (n = 8 всяка), както следва: групата с редовна контрола (R-C група), хранена с редовна диета; групата за контрол на мазнините (F-C група), хранена с високомаслена диета; групата с редовен модел (R-M група), хранена с редовна диета и подложена на имплантация на тумор; и групата на мастните модели (F-M група), хранени с диета с високо съдържание на мазнини и подложени на имплантация на тумор.

Част 2: Извършено е същото предварително лечение, както в част 1, за да се установи CRC модел, свързан със затлъстяването, и всички мишки бяха разделени в три групи (n = 8 всяка): контролната група, нелекувани и хранени с редовна диета; моделната група, хранени с диета с високо съдържание на мазнини и подложени на имплантация на тумор; и групата XTTF, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, подложени на имплантиране на тумор и след това лекувани с отвара от XTTF (3,536 mg/(g.d), веднъж дневно).

Всички мишки са били непрекъснато хранени с една и съща диета. След 4 седмици всички мишки бяха убити чрез дислокация на гръбначния стълб.

Хистологичен анализ и анализ на имунохистохимията (IHC)

Чернодробните тъкани бяха фиксирани в 10% фосфатно буфериран формалин, вградени в парафин и разделени на 5 μm. След това срезовете бяха оцветени с хематоксилин и еозин. Слайдовете бяха наблюдавани и заснети с микроскоп (Olympus BH2; Olympus, Tokyo, Japan).

Срезите с дебелина 5 μm, получени от фиксирани с формалин и вложени в парафин тъканни образци, рутинно се обезпаразитяват и рехидратират, последвано от ендогенно пероксидазно блокиране. Секциите бяха блокирани с 20% козе серумен албумин (Dako, Glostrup, Дания), последвано от инкубация с антитела към IGF-1, IGF-1R и IGFBP-3 за 2 часа. След това срезите бяха инкубирани с HRP-R/M (Dako) в продължение на 30 минути в съответствие с инструкциите на производителя и оцветени с хематоксилин. Положителните резултати се оцветяват в кафяво и се отчитат при × 400 увеличение.

Екстракция на РНК и верижна реакция на полимераза в реално време

Общата РНК се изолира от черния дроб, като се използва реактив Trizol, съгласно инструкциите на производителя. РНК се реверсира-транскрибира в cDNA и продуктът на обратната транскриптаза се амплифицира от генно-специфични праймерни двойки; глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа се използва като нормализиращ контрол. Праймерите (Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния, САЩ), използвани за откриване, са показани в Таблица 1. Условията на усилване са както следва: 40 цикъла по 2 минути предварително денатуриране при 94 ° C и 25 s денатурация при 94 ° С, последвано от 30 s отгряване. Реакциите бяха извършени в два екземпляра и данните бяха анализирани с помощта на 2 - △△ Ct метод. 11.

Таблица 1. PCR праймери за откриване.

Таблица 1. PCR праймери за откриване.

Статистически анализ

Анализът на дисперсията беше извършен с помощта на SPSS Версия 16.0 (SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ). Стойностите са представени като средно ± стандартно отклонение. Статистическата значимост между групите се определя чрез t-тест на Student или еднопосочен дисперсионен анализ. Стойността на р ≤ 0,05 се счита за статистически значима.

Етика

Всички експерименти с животни са проведени в съответствие с етичните насоки на Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd .; Шанхайски лабораторен център за животни към Китайската академия на науките; и принципа „3R“. Всички усилия бяха положени за минимизиране на страданията на животните. Изследователският проект е одобрен от Комитета по етика на Шанхай SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. и Шанхайския лабораторен център за животни към Китайската академия на науките.

Резултати

Затлъстяването увеличава растежа на солидни тумори и чернодробни метастази при CRC

Фигура 1. Затлъстяването увеличава растежа на солидни тумори и чернодробни метастази в CRC. (а) Диета с високо съдържание на мазнини, предизвикана от затлъстяване при мишки BALB/C. *** стр

Затлъстяването повишава експресията на протеини и нивата на иРНК на IGF-1 и IGF-1R и понижава нивото на IGFBP-3 в CRC

Нивата на IGF са тясно свързани с повишен риск от CRC. Фигура 2 (а) показва, че експресията на протеин на IGF-1 е била по-висока в R-M и F-C групите, отколкото в R-C групата и е била най-висока в F-M групата. Нивото на mRNA на IGF-1 е значително по-добро при F-M, отколкото при R-C групата (p Фигура 2 (d)). Същите констатации бяха получени за IGF-1R (Фигура 2 (b), (e)). Нивата на IGFBP-3 са по-ниски в R-M и F-C групите, отколкото в R-C групата и са най-ниски в F-M групата (Фигура 2 (c), (f)). Тези открития предполагат, че затлъстяването и CRC имат ефект върху нивата на IGF до известна степен и че затлъстяването може да насърчи регулиране на протеиновата експресия и нивото на иРНК на IGF-1 и IGF-1R, като същевременно понижава тези нива на IGFBP-3, като по този начин има положително влияние върху КРС.

Фигура 2. Ефект на затлъстяването върху експресията на протеин и нивата на иРНК на IGF-1, IGF-1R и IGFBP-3 на мишки BALB/C. Експресията на протеин на (a) IGF-1, (b) IGF-1R и (c) IGFBP-3 е количествено определена след имунохистохимичен анализ. Нивата на тРНК на (d) IGF-1, (e) IGF-1R и (f) IGFBP-3 бяха открити чрез полимеразна верижна реакция в реално време. Средното ± стандартно отклонение беше използвано за получаване на данните на тази фигура с помощта на софтуера SPSS. * стр

XTTF отварата значително увеличава телесното тегло на мишките и инхибира растежа на солидни тумори

Приложихме XTTF отвара при 3,536 mg/(g.d), за да оценим лечебния ефект на тази отвара върху CRC. След като мишките бяха убити, ние забелязахме, че туморите нарастват непрекъснато и че крайните тумори са видимо по-големи в моделната група, отколкото в останалите групи. Както е показано на Фигура 3 (а), мишките в групата XTTF показаха значително по-високо телесно тегло от тези в групата на модела (p Фигура 3 (в)). Тези данни показват, че отварата от XTTF може да подобри загубата на телесно тегло и да намали туморния растеж на CRC при мишки.

Фигура 3. XTTF отвара инхибира развитието на туморния растеж и чернодробните метастази при свързания със затлъстяването колоректален рак. Промени в (а) телесно тегло и (б) туморна част на мишки в моделната група след приложение на отвара от XTTF. (c) XTTF отварата значително намалява теглото на тумора и размера на метастатичната чернодробна тъкан. Средното ± стандартно отклонение беше използвано за получаване на данните на тази фигура с помощта на софтуера SPSS. ** стр

XTTF отварата потиска чернодробните метастази на CRC при мишки

Както е показано на Фигура 3 (d), ние наблюдавахме няколко бели възли на чернодробната повърхност в групата на модела, докато малко такива възли бяха открити в групата XTTF. Под микроскопа (Фигура 3 (б)) структурата на чернодробните лобули е значително повредена и не се вижда нормална чернодробна тъкан. Повечето тъкани са некротични и се наблюдава инфилтрация на голям брой метастатични ракови клетки. Цитоплазмата е с малък обем и е натрупана и тази находка е тясно свързана с макроскопското образуване на ракови възли. В групата на XTTF структурата на чернодробните лобули е относително интегрирана с леко инфилтриране само на няколко ракови клетки. Хистологичният анализ предполага, че отварата от XTTF може ефективно да потисне чернодробните метастази на CRC при мишки BALB/C.

XTTF отварата понижава експресията на протеини и нивото на иРНК на IGF-1 и IGF-1R и повишава IGFBP-3 в чернодробните метастази на CRC при мишки

В опит да се определи дали XTTF отварата има положително влияние върху чернодробните метастази чрез системата IGF, IHC анализ и полимеразна верижна реакция в реално време са били използвани за откриване на експресия на протеин и нива на иРНК на IGF-1, IGF-1R и IGFBP- 3 при чернодробни метастази.

Фигура 4. Ефект на отварата от XTTF върху експресията на протеин и нивото на иРНК на IGF-1, IGF-1R и IGFBP-3 при асоцииран със затлъстяването колоректален рак. Експресията на протеин на (a) IGF-1, (b) IGF-1R и (c) IGFBP-3 е количествено определена след имунохистохимичен анализ. Нивата на тРНК на (d) IGF-1, (e) IGF-1R и (f) IGFBP-3 бяха открити чрез полимеразна верижна реакция в реално време. Средното ± стандартно отклонение беше използвано за получаване на данните на тази фигура с помощта на софтуера SPSS. ** p ## p ### p

Резултатите, показани на Фигура 4 (d) и (e), показват, че нивата на mRNA на IGF-1 и IGF-1R очевидно са били по-ниски в групата на XTTF, отколкото в моделната група, докато нивото на mRNA на IGFBP-3 е значително увеличено в групата на XTTF (p 12 –14 След 2 седмици, очевидни възли са се образували и продължават да стават по-големи през целия период на изследване. Този резултат показва, че ние успешно установихме прост и възпроизводим CRC модел с висока степен на чернодробни метастази.

Все повече изследвания показват, че IGF са ключова потенциална цел в терапията на рака. IGF-1, важен митогенен фактор, се активира от инсулинова резистентност. Той може да насърчи клетъчната пролиферация и да инхибира клетъчната апоптоза. 15 IGF-1 се комбинира с IGF-1R и упражнява както автокринни, така и паракринни функции. IGFBP-3, растежен фактор, който насърчава клетъчната апоптоза, конкурентно се свързва с IGF-1R и функционира чрез настаняване на IGF-1 или дори функции, независими от IGF. 16 IGFBP могат да образуват комплекси с IGF-1, придружени от намаляване на количеството свободен IGF-1 на разположение и намаляване на IGF-1 медииран синтез на ДНК. 17 Затлъстяването, особено коремните мазнини, е основната причина за инсулинова резистентност. 18 Индуцираната от затлъстяването хиперинсулинемия може да увеличи чернодробния синтез на IGF-1 и да намали секрецията на IGFBP, което води до подобрени нива на циркулиращ IGF-1. 12 В настоящото проучване нивата на IGF-1 и IGF-1R бяха подобрени и нивата на IGFBP-3 бяха намалени в групата на модела, демонстрирайки наличието на тясна връзка между затлъстяването и CRC и възможността затлъстяването да насърчава чернодробната метастази в процеса на КРС.

Освен това, в едно проучване, нивата на IGF-1 mRNA в проби от рак на дебелото черво на човека са били 3 до 5 пъти по-високи от тези в нормалния епител на дебелото черво. 19 Експерименти с мишки също демонстрират, че намаляването на количеството IGF-1 и активността на IGF-1R в тъканта или кръвообращението може да потисне растежа на CRC клетките. 20,21 В настоящото проучване използвахме отвара XTTF за лечение на CRC, свързано със затлъстяването, при мишки. Мишките от лекуваната група показват много по-добри физически условия и чернодробни индекси. XTTF отварата значително намалява активността на IGF-1 и IGF-1R и очевидно подобрява активността на IGFBP-3. Въз основа на тези констатации, ние считаме, че отварата от XTTF, която осигурява изобилие от хранителни вещества и е ефективна съставка на вещества като полизахариди, вероятно инхибира чернодробните метастази и инхибира процеса на CRC чрез понижаване на регулирането на IGF-1 и IGF-1R и регулиране на IGFBP -3.

В обобщение, резултатите от това проучване показват, че затлъстяването може да стимулира туморния растеж и чернодробните метастази, да увеличи експресията на протеини и нивата на иРНК на IGF-1 и IGF-1R и да намали нивата на IGFBP-3, като всички те могат да бъдат обърнати чрез отвара от XTTF . По този начин, отварата XTTF е полезна за телесното здраве и може ефективно да инхибира чернодробните метастази при рак на CRC, което предполага, че отварата XTTF може да служи като потенциално лечение на CRC.

Декларация за конфликт на интереси

Авторът (ите) не декларира потенциален конфликт на интереси по отношение на изследванията, авторството и/или публикуването на тази статия.

Финансиране

Авторът (ите) разкрива получаването на следната финансова подкрепа за изследването, авторството и/или публикуването на тази статия: Тази работа е подкрепена от Националната природонаучна фондация на Китай „Ролята и механизмът на отварата Xiaotan Sanjie за миграцията на клетките и инвазия при рак на стомаха въз основа на пролиферация на CAF и свързана с нея експресия на фактори в микросредата на тумора ”(81603524) и фондовете за научни изследвания на традиционната китайска медицина на Общинското бюро по здравеопазване в Шанхай„ Клиничните ефекти на отварата от разпръскване на храчки и премахване на стагнацията “, използвана от професор Pinkang Wei за пациенти с умерен и напреднал рак на стомаха “(2012L092B).