1 Център за молекулярно изобразяване, Институт по молекулярна медицина на Фондация Браун, Център за здравни науки на Тексаския университет, Хюстън, Тексас 77030, САЩ

индуцирана

Резюме

Близкоинфрачервено флуоресцентно изобразяване (NIRFI) и далечночервено флуоресцентно изобразяване (FRFI) са използвани за изследване на ефектите от индуцирана от депилация пигментация на кожата и индуцирана от диетата фонова флуоресценция върху амплитудата на флуоресцентен сигнал и честотата на лимфна контракция при мишки C57BL6. Амплитудата на далечночервения флуоресцентен сигнал, но не и честотата, е била повлияна от индуцирана от диетата флуоресценция, която е била премахната чрез хранене на мишките с диета без люцерна, а пигментацията на кожата допълнително е повлияла на измерването на амплитудата. NIRFI показа минимална фонова флуоресценция; обаче, пигментацията на кожата намалява амплитудата на флуоресцентните промени в сигнала. Следователно тези ефекти трябва да се вземат предвид при изобразяване на мишки с различни състояния на пигментация на кожата и индуцирана от диетата фонова флуоресценция in vivo.

1. Въведение

В допълнение към пигментацията на кожата, известно е, че фоновата флуоресценция предоставя ограничение за in vivo флуоресцентно изобразяване. Доказано е, че след възбуждане от около 660 nm възбудителна светлина, мишките, хранени с нормална диета с животни, показват силна индуцирана от диетата флуоресценция в стомашно-чревния тракт (GI) в коремната област, тъй като хлорофил от люцерна при често използвани лабораторни гризачи диетите флуоресцират между 665 и 750 nm [4]. Следователно, мишките са били хранени с диета без люцерна за изображения с яркочервена флуоресценция (FRFI), използвайки флуорофори с възбудим червен цвят, като Cy5.5 и Alexa-680, или флуоресцентни протеини за намаляване на нежеланите фонови флуоресцентни сигнали [4, 5].

Наскоро ние и други разработихме флуоресцентни лимфни образи, използващи червени възбудими багрила (например IRDye680) или близки инфрачервени флуорофори (напр. Индоцианиново зелено (ICG)) [6–12]. От изображенията in vivo измерването на лимфната функция, като честота на лимфна контракция и амплитуда на флуоресцентен сигнал, е количествено определено. Не е съобщено обаче как тези измервания се влияят от промените в оцветяването на кожата и фоновата флуоресценция в резултат на диета, съдържаща люцерна. В настоящата работа ние изобразихме надлъжно и охарактеризирахме дермална лимфатика, използвайки флуоресцентно изобразяване с много вълни с инжектиране на смес от Alexa-680-говежди серумен албумин (BSA) и ICG в мишки C57BL6, които бяха хранени с редовна или без люцерна диета, в отговор на промени в пигментацията на кожата в резултат на химическа депилация.

2. Материали и методи

2.1. Животни

Шест до осемседмични женски мишки C57BL6 (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) бяха поддържани в колония без мишки в Института по молекулярна медицина Браун, Университет в Тексас, здравен научен център в Хюстън ( UTHSC-H), която е акредитирана от Асоциацията за оценка и акредитация на лабораторни грижи за животните. Мишките бяха хранени с редовна или без люцерна диета (AIN-93G; OpenSource Diets, New Brunswick, NJ, USA). Всички експерименти с животни се извършват след одобрение от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните.

2.2. Флуоресцентно изобразяване

Мишките бяха подстригани и депилаторът (Nair, Church & Dwight Co., Inc.) беше използван за отстраняване на остатъчните косми 24 часа преди фотографското изобразяване, всяка седмица, в продължение на 6 седмици. По време на изображенията животните се поставят под изофлуранова анестезия и се поддържат на 37 ° C подгряваща подложка. Флуоресцентно изобразяване беше проведено на 1 и 3 седмица. Обем от 10 ul от смес от Alexa-680-BSA (25 µg) и ICG (2.5 µж) се инжектира в основата на опашката с помощта на игла с 31 габарит. Мястото на инжектиране беше покрито с черна лента, за да се предотврати пренасищането на камерата. NIR и далечночервени флуоресцентни изображения са получени в продължение на 5 минути на 5 минути след инжектиране на сместа. Лазерен диод (500 mW, 785 nm за ICG възбуждане; 500 mW, 660 nm за възбуждане Alexa-680) осигурява възбудителна светлина, която равномерно осветява цялото тяло на мишката. За да отхвърлите обратно разсеяната и отразена възбуждаща светлина, холографски филтър за отхвърляне на лента плюс (785 nm и 660 nm централна дължина на вълната за NIRFI и FRFI, респ.) И лентов филтър (830 nm и 710 nm централна дължина на вълната за NIRFI и FRFI, респ. .) бяха позиционирани преди 50-мм обектив. Следователно, повторно излъчената флуоресцентна светлина е била открита от електронно умножаващо устройство, свързано със заряд (EMCCD) камера (фотометрия).

2.3. Анализ на данни

Данните бяха анализирани с ImageJ (Национален институт по здравеопазване, Bethesda, MD). Нивата на пигментация на кожата бяха измерени като средни стойности на сивото [3] чрез избор на области от интерес (ROI) върху междунодалните събиращи лимфни съдове в лявата странична страна на мишките във фотографските изображения, получени с помощта на стереомикроскоп. За да се разкрие контрактилна активност, беше избран същият размер на фиксирани ROI във флуоресцентни междунодални лимфни съдове, свързващи се от ингвиналния лимфен възел (ILN) с аксиларната LN (ALN) (на 1,5 cm от ILN). ROI са избрани на едно и също място при всички мишки. Получена е усреднената интензивност на флуоресценция във всеки ROI във всяко флуоресцентно изображение. Профилите бяха нормализирани до максимална интензивност и начертани като функция от времето за изобразяване. Броят на „импулсите“ е индикация за лимфна контрактилна активност и се нарича „контракции“. В допълнение, ROI в областта на стомаха е избрана за измерване на индуцирана от диетата фонова флуоресценция.

Данните бяха представени като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Статистическият анализ беше извършен с GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Данните бяха тествани за нормалност с помощта на тест за нормалност D’Agostino и Pearson Omnibus. За неразпределените данни на Gaussian е използван еднопосочен тест на ANOVA Friedman с тест за множествено сравнение на Dunn за множество сравнения или са използвани тестове на Mann-Whitney или Wilcoxon за сравняване съответно на две несдвоени или сдвоени групи. Освен това бяха направени сравнения между две групи със Student т-тест за сдвоени или несдвоени параметрични данни. Статистическата значимост се базира на

се счита за значителна разлика.

3. Резултати

Мишките се депилираха всяка седмица и се снимаха ден по-късно. Както е показано на фигура 1, мишките C57BL6 след първата депилация (седмица 1) показват розова кожа в по-голямата част от тялото на животното, въпреки че някои области са пигментирани (стрелка на фигура 1). Визуалното наблюдение от фотографските изображения демонстрира повишена пигментация в кожата на мишки до 3 седмици след депилация, когато пигментацията на кожата е най-голяма, и връщане към изходните нива през седмица 4. Такива циклични промени продължават около 4 седмици преди кожната пигментация да започне отново. Не наблюдавахме временни промени в пигментацията на кожата на цялото тяло (Фигура 1). Средните стойности на сивото, използвани за измерване на нивото на пигментация на кожата, както е показано на Фигура 1 (b), са значително намалени на 3-та седмица в сравнение със 1-ва седмица (

), в съгласие с визуалното наблюдение.

; еднопосочен тест на ANOVA Friedman с тест за множество сравнения на Dunn). Данните са показани като средно ± SEM. Стрелка, пигментирани региони на 1 седмица.

След това интрадермално инжектирахме два различни образни агента с различна дължина на вълната на възбуждане/излъчване, първо отделно, а след това и смес от тях, в кожата на гърба на мишките, за да проучим дали има припокриващи се флуоресцентни емисионни сигнали. Както е показано на Фигура 2, открихме различна флуоресценция на ICG и Alexa-680 в местата за инжектиране на всяко отделно инжектирано багрило, както и сместа, при мишки на седмица 1 след депилация.


След това инжектирахме смес от образни средства в основата на опашката и извършихме динамично флуоресцентно лимфно изобразяване, за да проследим затихването на флуоресцентните емисионни сигнали поради пигментация на кожата. Всички мишки показаха лимфен дренаж от основата на опашката към ILN и накрая към ALN чрез интернодални събиращи лимфни съдове. Наблюдавахме намалена флуоресцентна емисия при пигментирани мишки (Фигура 3; лента за калибриране на сигнала). В групи от мишки, хранени с диета без люцерна, наблюдаваме липса или минимален фон в стомашно-чревния трак (GIT) (коремна област) на мишки с флуоресцентно изобразяване Alexa-680, докато мишките, хранени с редовна диета, показват висока фонова флуоресценция в GIT (Фигура 3 и Таблица 1). NIRFI не показва свързана с диетата фонова флуоресценция (Таблица 1).

мишки на група. срещу мишки, хранени с диета без люцерна. Несдвоен студент т-е извършен тест.


) диета след NIRFI (бяла) и FRFI (черна). Данните са показани като средно ± SEM. Сдвоен и несдвоен ученик т-тестовете бяха извършени в (в). Тестовете на Mann-Whitney и Wilcoxon бяха използвани за сравняване на две несдвоени или сдвоени групи, съответно, в (d). . . . NS, без значение ().

4. Дискусия

В заключение, индуцираната от диетата фонова флуоресценция, получена с помощта на FRFI, значително влияе върху лимфното измерване на амплитудата на флуоресцентния сигнал, но не и върху честотата на лимфните контракции в междунодалните събиращи лимфни съдове при мишки, хранени с редовна диета, и пигментацията на кожата допълнително влияе върху амплитудата. Храненето на мишки с диета без люцерна премахва автофлуоресценцията, причинена от диетата и по този начин подобрява амплитудата. Въпреки че NIRFI не показва или има минимална фонова флуоресценция при мишки нито при обикновена диета, нито при люцерна, пигментацията на кожата влияе върху амплитудата на NIR промени на флуоресцентния сигнал. Следователно трябва да се внимава да се изследва надлъжно изобразяване на мишки C57BL6 и при изобразяване на групи мишки с различен статус на пигментация на кожата in vivo.

Конфликт на интереси

Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена отчасти от Националните здравни институти, R21 CA159193 (Sunkuk Kwon) и R01 CA128919 (Eva M. Sevick-Muraca).

Препратки

  1. К. С. Стен и Р. Паус, „Контрол на циклирането на космените фоликули“, Физиологични прегледи, об. 81, бр. 1, стр. 449–494, 2001. Преглед в: Google Scholar
  2. Л. Алонсо и Е. Фукс, „Цикълът на косата“, Списание за клетъчна наука, об. 119, бр. 3, част 3, стр. 391–393, 2006. Преглед на: Сайт на издателя | Google Scholar
  3. A. Curtis, K. Calabro, J.-R. Galarneau, I. J. Bigio и T. Krucker, „Временните вариации на кожната пигментация при мишки C57Bl/6 влияят на количественото определяне на оптичната биолуминесценция“, Молекулярни образи и биология, об. 13, бр. 6, стр. 1114–1123, 2011. Изглед на: Сайт на издателя | Google Scholar
  4. T. Troy, D. Jekic-McMullen, L. Sambucetti и B. Rice, „Количествено сравнение на чувствителността на откриване на флуоресцентни и биолуминесцентни репортери в животински модели“, Молекулярно изображение, об. 3, бр. 1, стр. 9–23, 2004. Преглед на: Издателски сайт | Google Scholar
  5. Y. Inoue, K. Izawa, S. Kiryu, A. Tojo и K. Ohtomo, „Диета и коремна автофлуоресценция, открита чрез in vivo флуоресцентно изобразяване на живи мишки“ Молекулярно изображение, об. 7, бр. 1, стр. 21–27, 2008. Преглед на: Издателски сайт | Google Scholar
  6. S. Liao, G. Cheng, D. A. Conner et al., „Нарушена лимфна контракция, свързана с имуносупресия“, Известия на Националната академия на науките на Съединените американски щати, об. 108, бр. 46, стр. 18784–18789, 2011. Изглед в: Google Scholar
  7. S. Kwon и E. M. Sevick-Muraca, „Неинвазивно количествено изобразяване на лимфната функция при мишки“, Лимфни изследвания и биология, об. 5, бр. 4, стр. 219–231, 2007. Преглед на: Издателски сайт | Google Scholar
  8. S. Kwon и E. M. Sevick-Muraca, „Функционално лимфно изобразяване при мишки, носещи тумор“, Списание за имунологични методи, об. 360, не. 1-2, стр. 167–172, 2010. Преглед на: Издателски сайт | Google Scholar
  9. S. Kwon и E. M. Sevick-Muraca, „Фенотипиране на мишки с близка инфрачервена флуоресцентна лимфна картина“, Биомедицинска оптика Експрес, об. 2, бр. 6, стр. 1403–1411, 2011. Преглед на: Издателски сайт | Google Scholar
  10. S. T. Proulx, P. Luciani, S. Derzsi et al., „Количествено изобразяване на лимфната функция с липозомно индоцианиново зелено“ Изследване на рака, об. 70, бр. 18, стр. 7053–7062, 2010. Преглед на: Издателски сайт | Google Scholar
  11. S. T. Proulx, P. Luciani, A. Christiansen et al., "Използване на PEG-конюгирана ярка близка инфрачервена боя за функционално изобразяване на пренасочване на туморен лимфен дренаж след метастази на сентинелни лимфни възли," Биоматериали, об. 34, бр. 21, стр. 5128–5137, 2013. Преглед на: Сайт на издателя | Google Scholar
  12. M. Weiler, T. Kassis и J. B. Dixon, „Анализ на чувствителността на близки инфрачервени функционални лимфни образи“, Списание за биомедицинска оптика, об. 17, бр. 6, ID на статия 066019, 2012. Преглед на: Сайт на издателя | Google Scholar
  13. A. Slominski, J. Wortsman, P. M. Plonka, K. U. Schallreuter, R. Paus и D. J. Tobin, „Пигментация на космените фоликули“, Списание за разследваща дерматология, об. 124, бр. 1, стр. 13–21, 2005. Преглед на: Издателски сайт | Google Scholar
  14. С. Л. Жак, „Оптични свойства на биологичните тъкани: преглед“, Физика в медицината и биологията, об. 58, бр. 11, стр. R37 – R61, 2013. Преглед на: Сайт на издателя | Google Scholar
  15. D. K. Sardar, M. L. Mayo и R. D. Glickman, „Оптично характеризиране на меланин“, Списание за биомедицинска оптика, об. 6, бр. 4, стр. 404–411, 2001. Преглед на: Издателски сайт | Google Scholar
  16. N. Kollias и A. Baqer, „Спектроскопски характеристики на човешкия меланин in vivo,“ Списание за разследваща дерматология, об. 85, бр. 1, стр. 38–42, 1985 г. Преглед на: Издателски сайт | Google Scholar
  17. S.-H. Tseng, P. Bargo, A. Durkin и N. Kollias, „Хромофорни концентрации, абсорбционни и разсейващи свойства на човешката кожа in vivo“, Optics Express, об. 17, бр. 17, стр. 14599–14617, 2009. Преглед на: Издателски сайт | Google Scholar