Партньорски център за молекулярна имунология и инфекциозни болести, Катедра по биохимия и молекулярна биология, Катедра по ветеринарни и биомедицински науки, Държавният университет в Пенсилвания, Университетски парк, Пенсилвания, Съединени американски щати

диетата

Партньорски център за молекулярна имунология и инфекциозни болести, Катедра по биохимия и молекулярна биология, Катедра по ветеринарни и биомедицински науки, Държавният университет в Пенсилвания, Университетски парк, Пенсилвания, Съединени американски щати

Партньорски център за молекулярна имунология и инфекциозни болести, Катедра по биохимия и молекулярна биология, Катедра по ветеринарни и биомедицински науки, Държавният университет в Пенсилвания, Университетски парк, Пенсилвания, Съединени американски щати

Партньорски център за молекулярна имунология и инфекциозни болести, Катедра по биохимия и молекулярна биология, Катедра по ветеринарни и биомедицински науки, Държавният университет в Пенсилвания, Университетски парк, Пенсилвания, Съединени американски щати

Партньорски център за молекулярна имунология и инфекциозни болести, Катедра по биохимия и молекулярна биология, Катедра по ветеринарни и биомедицински науки, Държавният университет в Пенсилвания, Университетски парк, Пенсилвания, Съединени американски щати

Партньорски център за молекулярна имунология и инфекциозни болести, Катедра по биохимия и молекулярна биология, Катедра по ветеринарни и биомедицински науки, Държавният университет в Пенсилвания, Университетски парк, Пенсилвания, Съединени американски щати

Партньорски център за молекулярна имунология и инфекциозни болести, Катедра по биохимия и молекулярна биология, Катедра по ветеринарни и биомедицински науки, Държавният университет в Пенсилвания, Университетски парк, Пенсилвания, Съединени американски щати

  • Jot Hui Ooi,
  • Аманда Уодел,
  • Ян-Дин Лин,
  • Ищван Алберт,
  • Лора Т. Ръжда,
  • Виктория Холдън,
  • Маргарита Т. Канторна

Фигури

Резюме

Цитат: Ooi JH, Waddell A, Lin Y-D, Albert I, Rust LT, Holden V, et al. (2014) Доминиращи ефекти на диетата върху микробиома и местния и системен имунен отговор при мишки. PLoS ONE 9 (1): e86366. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086366

Редактор: Сюзън Коватс, Фондация за медицински изследвания в Оклахома, Съединени американски щати

Получено: 30 септември 2013 г .; Прието: 6 декември 2013 г .; Публикувано: 29 януари 2014 г.

Финансиране: Подкрепена отчасти от Националния здравен институт/Национален институт по неврологични и инсулт Grant NS067563 и Националния център за допълваща и алтернативна медицина и Службата за хранителни добавки AT005378 и Националния център за ресурсни грижи за гнотобиотици, Национални здравни институти отпускат 5-P39- DK034987 И 5-P40-OD010995. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Имуно-медиираните заболявания, включително възпалително заболяване на червата (IBD), множествена склероза (MS), артрит и други са се увеличили в честотата през последните 50 години. Смята се, че 1,4 милиона души в Съединените щати и 4 от 1000 души по света страдат от IBD [1], [2]. Комбинацията от генетични и екологични фактори определя кои индивиди развиват имунно-медиирани заболявания. Идентични изследвания на близнаци установяват, че има силно влияние на околната среда върху имуно-медиираните заболявания, тъй като степента на съвпадение при еднояйчни близнаци е 14-50% за IBD и 25% за МС [3], [4]. В допълнение, бързото нарастване на имуно-медиираните заболявания за кратък период от време трябва да се дължи на промени в околната среда.

Епидемиологичните проучвания показват роля за факторите на околната среда както при МС, така и при ВБИ. Диетата е идентифицирана като възможен фактор на околната среда, който предразполага към IBD [5]. Въпреки това, ефектите от диетата върху имунно-медиираните заболявания извън стомашно-чревния тракт (като МС) не са добре проучени. IBD е по-разпространен в западните страни, отколкото в източните страни [6]. Японски и китайски имигранти в западните страни повишават риска от развитие на IBD, което предполага връзка между честотата на IBD и промените в околната среда, като адаптация към западна диета [6], [7]. Диетите с високо съдържание на мазнини и протеини са свързани с патогенезата на възпалителните заболявания [8]. Трудно е да се установи кои диетични фактори влияят на сложни заболявания като IBD и MS.

Втори фактор на околната среда, който е важен за етиологията на имунно-медиираните заболявания, особено IBD, е коменсалната флора, открита в стомашно-чревния тракт [9] - [11]. Проучванията показват, че промените в чревната флора (дисбиоза) са довели до IBD при генетично предразположени индивиди [9]. Доказано е, че лечението с антибиотици (ABX) и прилагането на пробиотици подобряват симптомите на IBD при някои индивиди [12] - [14]. Пациентите с IBD са имали по-голям брой членове на Proteobacteria и Actinobacteria phyla и по-малък брой на Bacteroidetes тип в червата в сравнение със здравите контроли [15]. Ефектът на микробиома върху пациенти с други имунно-медиирани заболявания като MS не е описан досега. Ясна роля на микробиотата може да бъде демонстрирана в експериментални модели на МС (експериментален автоимунен енцефаломиелит (EAE)) и IBD (мишки с интерлевкин (IL) -10 с нокаут (KO)), тъй като мишките без микроби развиват по-леко или никакво заболяване [16], [17]. Тези експерименти, използващи мишки с гнотобиотик, демонстрират значението на микробиома при имуно-медиирани заболявания.

Краткосрочните диетични лечения (2 седмици) бяха тествани за въздействието им върху микробиома и върху имунно-медиираните заболявания на червата и централната нервна система. Доказано е, че три хранителни лабораторни диети повлияват чувствителността на мишките към индуциран от декстран натриев сулфат (DSS) колит и EAE. Освен това имаше медиирани от диетата ефекти върху изчистването на инфекция с Citrobacter rodentium. Пречистената диета (PD), направена в лабораторията, беше защитна за трите модела в сравнение с храненето на едни и същи мишки от див тип (WT) или със стандартна лабораторна диета от чау (CD), или със специално формулирана пречистена диета (Teklad diet, TD). Диетичните лечения засягат състава на фекалната бактериална микробиота, а нарушаването на ABX на микробиотата намалява ефекта от диетата върху чувствителността към болести. Няма ефект от диетата върху чувствителността към DSS при мишки без микроби. Защитните ефекти на PD бяха изключително бързи, тъй като преминаването към PD защити 1d преди и 2d след индукцията на DSS колит. Краткосрочните диетични лечения могат да бъдат полезни за изместване на чревната микробиота и подобряване на имуно-медиираните заболявания.

Материали и методи

Мишки и диета

DSS-индуциран колит

На мишките беше даден DSS за предизвикване на колит, както беше описано по-рано [20]. Накратко, мишките бяха третирани с 2,5% DSS (ICN Biomedicals, Aurora, OH) в питейна вода за 5d и след това върнати в обикновена питейна вода за остатъка от експеримента (дни 6-14). 3,5% DSS е използван за експериментите, които добавят нарастващи количества лактоза към PD диетата, за да увеличат степента на нараняване и да засилят разликите между групите. Промените в телесното тегло (BW) се наблюдават всеки ден. Резултатите от кръвта на дебелото черво са по скала от 0–3, както е описано по-горе [20]. Дисталните дебелото черво са обработени и оценени, както е описано по-рано по скала от 0-15 [20].

C. rodentium инфекция

Щамът C. rodentium ICC169 е подарък от д-р Гад Франкел (Лондонско училище по медицина и стоматология, Лондон, Великобритания). C. rodentium се култивира в продължение на една нощ в LB бульон, съдържащ 50 µg/ml налидиксинова киселина (EMD химикали, Gibstown, NJ), след което 5 × 10 9 CFU на C. rodentium в PBS се изследва орално при мишки [21]. Фекални проби бяха събрани и хомогенизирани в PBS (0,1 g изпражнения в 1 ml PBS) за наблюдение на отделянето на фекалиите. Серийните разреждания се поставят в три екземпляра върху LB агарови плаки, съдържащи налидиксинова киселина и се култивират в продължение на една нощ при 37 ° С, за да се преброят колониите. Вторичните инфекции се извършват 1 седмица, след като всички мишки са изчистили първичната инфекция. Вторични инфекции, използвани 5 × 10 9 C. rodentium в PBS и доставени чрез орален сондаж. Хистопатологията на дисталното дебело черво е оценена по скала от 0–8, като се използват предварително описани критерии [21].

Мишките се инжектират подкожно с 200 µg MOG35–55 (аминокиселинна последователност, MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; Anaspec, Fremont, CA), емулгирани в пълен адювант на Freund (Difco, Детройт, Мичиган), допълнен с 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37RA (Hicora, H37RA) ). На d0 и d2 след имунизация, мишките се инжектират интраперитонеално с 200 ng коклюшен токсин (List Biological Laboratories, Campbell, CA) в 100 uL PBS. Клиничните симптоми на EAE се оценяват ежедневно и се оценяват, както е описано по-рано по скала от 0–5 [22]. Мишките с EAE резултат 2 или повече се считат за EAE положителни. Кумулативният индекс на болестта се изчислява чрез добавяне на дневните резултати за активността на заболяването през 21d от експеримента. Едноклетъчни суспензии на дрениращите лимфни възли бяха събрани и рестимулирани с 20 µg/mL MOG35-55 пептид. 72 h супернатанти бяха събрани за анализ чрез ELISA.

Денатурираща градиентна гел електрофореза (DGGE)

Фекални проби бяха събрани чрез поставяне на мишки в чисти празни клетки и ДНК беше изолирана и анализирана точно както е описано [21]. PCR продукти от бактериална ДНК, изолирани от пречистени култури от Clostridium propionicum (щам ATCC 25522), Lactobacillus murinus (щам ATCC 35020) и Parabacteroides distasonis (щам ATCC 8503), са използвани като стандарти (STD) за сравняване на миграцията на ленти между геловете в различни дни.

Метагеномичен анализ

ELISA

IL-17 и IFN-y ELISA бяха направени с помощта на комплекти, следвайки инструкциите на производителя (BD Bioscience, Сан Диего, Калифорния). 30 µg/ml обработен с ултразвук протеин на C. rodentium се покрива върху 96-ямкови плаки като улавящ антиген за количествено определяне на C. rodentium-специфични IgA и IgG в пробите и се използва HRP-конюгиран анти-миши IgA и HRP-конюгиран анти-мишка IgG, съответно (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Стойностите се отчитат като специфични за C. rodentium IgG или IgA спрямо обединения серум, използван за генериране на стандартна крива.

Статистически анализ

Когато е възможно, сме показали всички точки от данни от множество експерименти (експерименти с C. rodentium). За колит EAE и DSS имаше значителна променливост в кинетиката и тежестта на заболяването, която не успяхме да контролираме. За тези експерименти показахме един представител на два или три отделни експеримента. Тестът на несдвоения студент, еднопосочен ANOVA с пост-тестове на Tukey и двупосочен ANOVA с пост-тестове на Bonferroni бяха използвани за изчисляване на статистическа значимост чрез софтуера GraphPad Prism (GraphPad, La Jolla, CA). За метагеномичен анализ беше приложен тест на Pearson Chi-Square Goodness of Fit с помощта на P Фигура 1. Променени от диетата промени в чувствителността към DSS.

WT или Rag KO мишки бяха хранени с експериментални диети за 2% DSS лечение и през целия експеримент. Процент оригинални BW на (A) WT (n = 4–6 мишки/група) и (B) Rag KO мишки след началото на DSS лечението (n = 3–5 мишки/група). И трите диетични групи се различават значително една от друга (* P Фигура 2. Хранителният състав на диетите.

За да се определи дали съдържанието на лактоза в CD и TD диетите е отговорно за тежките симптоми на DSS, до 20% лактоза е добавена към PD. Добавянето на 5% лактоза към PD води до по-малка загуба на тегло след DSS от 0% лактоза, съдържаща PD (P = 0,0001, Фигура S1). 10% лактоза не се различава от PD и 20% хранени с лактоза мишки губят значително повече тегло след DSS от PD-хранени мишки (P = 0,0076) (Фигура S1). Въпреки това други симптоми на DSS колит (скъсяване на дебелото черво) не са станали по-тежки чрез добавяне на до 20% лактоза към PD (данните не са показани). Самото съдържание на лактоза не отчита медиираните от диетата ефекти на DSS върху мишки.

Диетично медиирани промени в състава на фекалната микробиота

За да се определи дали диетата е довела до промени в състава на бактериалната микробиота, се събират изпражнения за изолиране на ДНК от мишки, хранени с различни диети преди индукция на DSS и се анализират с помощта на DGGE (Фигура 3А). По-рано показахме, че превключването на мишките от стандартни диети на CD към PD води до промяна в моделите на лентовидност на DGGE, така че след превключването има само 47% сходство с модела на лентиране преди превключването [19], [21]. Мишките на една и съща диета показаха най-голяма степен на сходство в микробните модели на ивици DGGE [19], [21]. Сравнението на различните модели на ивици на DGGE показа, че сходството на моделите на ивици е високо в изпражненията на мишки, хранени със същите диети (60% сходство при хранене с PD и 50% сходство при хранене с TD, Фигура 3B) и по-ниско при сравняване на лентата модел между PD- и TD-хранени мишки (39% сходство, Фигура 3В). Общото количество бактериална ДНК във фекалиите не се различава между PD- и TD-хранените мишки (PCR в реално време, данните не са показани). Самите диети са допринесли с остатъчна бактериална ДНК (Фигура S1). PD и TD имаха ДНК на Lactococcus lactis в тях и освен това TD съдържаха и ДНК от видове Leuconostoc (Фигура S1). Тези организми обаче присъстват в много ниско количество (Фигура 3. Диетично-медиирани ефекти върху фекалната микрофлора.

(A) DGGE пръстови отпечатъци на фекална ДНК от PD-хранени (линии 1–4) и TD-хранени мишки (линии 5–8) (n = 4 мишки/група). Показаните данни са един представител на три независими експеримента. (B) Клъстерен анализ, показващ измерванията на сходството на моделите на лентовите връзки DGGE, показани в панел А. (C) Метагеномният анализ показва изобилието на бактериална фила, присъстваща в изпражненията от PD- и TD-хранени мишки (n = 2 мишки/група). (D) Изобилие от бактериални семейства в Firmicutes phylum, присъстващо в изпражнения от PD- и TD-хранени мишки (n = 2 мишки/група). Установена е значителна разлика в множество бактериални видове и фамилии между PD и TD (*** P Фигура 4. ABX лечения са защитили PD- и TD-хранени мишки от DSS-индуциран колит.

WT мишките бяха третирани непрекъснато с ABX и хранени PD или TD за 2% DSS лечение. (A) Процент оригинални BW на ABX-третирани PD- или TD-хранени мишки след началото на DSS лечение (n = 3-4 мишки/група). Установена е значителна разлика в промяната на BW при PD срещу TD, PD срещу PD ABX, TD срещу TD ABX и PD ABX спрямо TD ABX (*** P Фигура 5. Диетично медиирани ефекти върху първична и вторична инфекция с C. rodentium.

(A) Изхвърляне на C. rodentium във фекалиите след първична инфекция (n = 14 мишки/група). (B) Изхвърляне на C. rodentium във фекалиите след вторична инфекция (n = 14 мишки/група). Стойностите са средните стойности +/− SEM. TD се различава значително от PD (* P Фигура 6. Диетично медиирани ефекти върху развитието на EAE при WT мишки.