Антиоксидантният кофактор алфа-липоева киселина може да контролира ендогенния метаболизъм на формалдехид при бозайници

ibg.waykun.com - Диета и загуба на тегло, днес

Анастасия В. Шиндяпина

1 Катедра по генетика и биотехнологии, Институт по обща генетика на Н. И. Вавилов, Руска академия на науките, Москва, Русия

2 Катедра по химия и биохимия на нуклеопротеините, Институт по физико-химична биология А. Н. Белозерски, Московски държавен университет "Ломоносов", Москва, Русия

Татяна В. Комарова

Екатерина В. Шешукова

Наталия М. Ершова

Вадим Н. Ташлицки

3 Химически факултет, Московски държавен университет „Ломоносов“, Москва, Русия

Александър В. Куркин

3 Химически факултет, Московски държавен университет „Ломоносов“, Москва, Русия

Илдар Р. Юсупов

3 Химически факултет, Московски държавен университет „Ломоносов“, Москва, Русия

Гарик В. Мкртчян

Мурат Й. Шагидулин

4 Академик В. И. Шумаков Федерален изследователски център по трансплантология и изкуствени органи, Москва, Русия

Юрий Л. Дорохов

Свързани данни

Резюме

Въведение

При бозайниците окисляването на метаболитни късоверижни алкохоли, като метанол (MeOH) и етанол (EtOH), се осъществява с участието на ензими от класа на алкохолната дехидрогеназа 1 (ADH1) (Cederbaum, 2012; Wang et al., 2012; Edenberg and Foroud, 2013; Dorokhov et al., 2015). МеОН, произведен от пектин метилестерази (РМЕ) на стомашно-чревния микробиом или от растителни ПМЕ, консумирани с растителна храна (Дорохов и др., 2012, 2015; Комарова и др., 2014; Shindyapina et al., 2014), неизменно се преобразува от ADH1 ензим до формалдехид (FA) в организмите на бозайници. MeOH не е единственият източник на метаболитни FA; може също да се образува в резултат на (а) медиирано от семикарбазид аминооксидазно окислително дезаминиране на метиламин, получен от креатинин (Charlton and Mack, 1994; Lee et al., 2008) и (b) ремоделиране на хроматиновата структура в реакция на отстраняване на метилови групи от лизинови остатъци в хистони, която се катализира от лизин-специфична деметилаза 1 и JmjC домен-съдържащи хистонови деметилази (Tsukada et al., 2006; Cloos et al., 2008; Hou и Yu, 2010; Walport et al., 2012; Liu et al., 2013).

FA изглежда е съответният агент в невродегенерацията (по-долу); окисляването му до мравчена киселина в този контекст представлява детоксикация. FA се превръща в мравчена киселина с участието на ензими главно от класа на алдехиддехидрогеназа 2 (AlDH2) (Sládek, 2003; Sophos и Vasiliou, 2003). Окислението на FA също се осъществява чрез участието на ADH5 или глутатион-зависимия χ-ADH FA дехидрогеназа (FDH) ензим (Tulpule et al., 2013). В същото време е известно, че каталаза (CAT) (Cederbaum and Qureshi, 1982; Deng and Deitrich, 2008) и цитохром P450 (CYP2E1) (Coon and Koop, 1987; Caro and Cederbaum, 2004; Wallage and Watterson, 2008 ) са включени в процеса на алкохолен метаболизъм при високи концентрации на алкохол. Важно е да се отбележи, че в тъканите на мозъка и черния дроб регулирането на нивата на МеОН се извършва по различни начини. Ензимът ADH1 окислява по-голямата част от MeOH в човешкия черен дроб, докато в мозъчните клетки активността му е близка до нула (Julià et al., 1987; Galter et al., 2003; Tulpule and Dringen, 2013). Очевидно ниската активност на ензима ADH1 в човешките мозъчни клетки действа като механизъм за защита срещу вредното въздействие на FA върху невроните (Tulpule and Dringen, 2013).

Известно е, че хроничното излагане на FA причинява остри здравословни проблеми (Tang et al., 2009), свързани с агрегирането на амилоиди (Chen et al., 2007), агрегацията на tau протеини и хиперфосфорилирането in vitro и in vivo (ENCODE Project Consortium et al., 2007; Liu et al., 2013; Su et al., 2016). Предполага се, че FA токсичността е свързана с основните белези на свързаното с възрастта увреждане на невроните и патологията на болестта на Алцхаймер (Tong et al., 2011, 2013a, b, 2017; Liu et al., 2013). Повишените нива на ФА, открити при болестта на Алцхаймер (Tang et al., 2013a, b; Tong et al., 2013a, 2017), могат да играят важна роля в β-амилоидната (Aβ) агрегация и церебралната амилоидна ангиопатия (Li et al., 2016б).

По този начин може да се приеме, че ALA може да изпълнява функцията на регулатор на активността на ALDH2 при бозайници и по този начин може да контролира метаболизма на FA. За да тестваме това предположение, ние изследвахме ефекта на ALA върху метаболизма на FA при мишки. Нашите резултати показаха, че ALA е в състояние да намали екзогенните и метаболитни нива на MeOH и FA при мишки. Механизмът на елиминиране на FA включва повишена регулация на гените, отговорни за неговия метаболизъм (ADH1, ALDH2, CAT, CYP2E1) в хипокампуса и далака и повишена ензимна активност на ALDH2 в мозъка на мишка.

Материали и методи

Материали

β-никотинамид аденин динуклеотид, ацетонитрил (HPLC клас) и Triton X-100 са закупени от PanReac AppliChem, коктейл за спиране на протеазни инхибитори (100Х) и 16% формалдехид без метанол от Thermo Fisher Scientific, TriReagent от MRC. Alda-1 е синтезиран от д-р А.В. Куркин (Московски държавен университет, Русия). Всички други химикали са от Sigma Aldrich (Виена, Австрия), ако не е посочено друго.

Животни и in vivo лечение

Техника за перфузия на черен дроб на плъх

Всички манипулации се извършват при стерилни условия, като се вземат предвид асептичните и антисептичните изисквания. Анестезията на експериментални животни се извършва чрез инжектиране на разтвора Zoletil 50 (Virbac Sante Animale, Франция) в коремната кухина в доза 7,5 mg/kg телесно тегло. За целите на системната хепаринизация, хепаринът се прилага върху вената на пениса в доза от 200 единици. След това беше извършена средна лапаротомия. Използвайки специална канюла (Venflon 1,3 × 45 mm), порталната вена (Vena portae) беше канюлирана и към порталната вена бяха добавени допълнителни 150 единици хепарин. Веднага след това подхепатичният клон на порталната вена е лигиран. Измиването на черния дроб от кръвните елементи се извършва с кислороден (95% O2 и 5% CO2) Krebs-Henseleit буфер (118 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,75 mM CaCl2, 1,19 mM KH2PO4, 1,18 mM MgSO4 и 25 mM NaHCO3, pH 7,4 при t = 37,8 ° C) в обем от 500 ml с перисталтична помпа, създавайки дебит от 2,5–4,0 ml/min/g и физиологично налягане от

12–15 mm Hg във порталната вена. Използвана е система за рециркулираща перфузия. В плевралната част се дисектира надхепаталният клон на кухата вена и се отстранява перфузатът. Качеството на чернодробната перфузия се оценява въз основа на целостта на органа, еднородността на бледия цвят и консистенцията (степен на оток). След измиване на кръвни елементи от черния дроб се извършва експлантация на черния дроб и се извършва изолирана перфузия. MeOH (120 mg/kg) и ALA (20 mg/kg) бяха последователно добавени към горния резервоар за перфузат. Вземат се проби на всеки 15 минути в продължение на един час с 2 ml перфузат.

Анализ на чернодробните ензими

Измерванията на AST, ALT и ALP бяха извършени на анализатор A25 (Biosystems, Испания) с търговски комплекти, произведени от Hospitex Diagnostics (Италия), съгласно инструкциите на производителя. Спектрофотометърът се калибрира преди всяко измерване на ензима.

FA измерване чрез HPLC

Измервания на MeOH чрез GC

Съдържанието на MeOH се анализира на хроматограф Kristall 5000 (Chromatek, Русия) при следните условия: колона Sol-Gel Wax 30 * 0,25 * 0,25 и пламъчно-йонизационният детектор (FID), температурата и температурата на инжектора са настроени на 220 ° C. Температурата на фурната се задържа за 1 min при 50 ° C, последвана от повишаване при 20 ° C/min до 100 ° C (задържане за 1 min) и завършваща при 200 ° C след повишаване със скорост 20 ° C мин. Потоците на азот, водород и въздух са съответно 30, 40 и 400 ml/min. Инжекционният обем на пробите е 1 μl.

qRT-PCR

Концентрациите на РНК се определят с помощта на спектрофотометър Nanodrop ND-1000 (Isogen Life Sciences). Всички проби от РНК са имали съотношение на абсорбция 260/280 между 1,9 и 2,1.

Измерване на ензимната активност на ALDH2 в мозъка на мишката

На мишките се прилага ALA (20 mg/kg) едновременно с 4-MP (10 mg/kg) и 90 минути по-късно мозъчните общи фракции на митохондриалните и цитоплазмените протеини се разделят, както е описано по-горе (Bunik et al., 2008 ). Анализът на ALDH2 се провежда в 200 μl, съдържащ 50 mM натриев пирофосфатен буфер рН 8,1, 0,1 mM NAD +, 50 mM FA и 20 μl от мозъчната митохондриална фракция. ALDH2 и фоновите реакции (без FA) се записват паралелно в продължение на 20 минути при 340 nm в черните плаки (25 ° С). Дейностите на ALDH2 бяха нормализирани за общото съдържание на протеин (mg), измерено с помощта на Pierce BCA Protein Assay Kit съгласно протокола на производителя.

GSH измерване в мозъка на мишката

GSH се измерва като се използва 5,5′-дитио-бис (2-нитробензоена киселина) (DTNB). Цитоплазмените клетъчни фракции (80 μl) се смесват с 30 μl 10 mM DTNB и 0,2 М Na2HPO4 до краен обем от 300 μl и 15 минути по-късно се записва абсорбция при 412 nm. Концентрациите на GSH бяха нормализирани за общото съдържание на протеин (mg), измерено с помощта на Pierce BCA Protein Assay Kit съгласно протокола на производителя.

Синтез на микрочипове

Синтезатор на микрочипове B3 (CustomArray, САЩ) е използван за синтез на олигонуклеотидна сонда с дължина 40 нуклеотиди на слайдове CustomArray ECD 4X2K/12K. Синтезът беше извършен съгласно препоръките на производителя. Две копия на общо 6020 уникални олигонуклеотидни сонди, специфични за 2 091 мишки генни транскрипти, бяха поставени на всеки чип. Проектирането на чипове е извършено с помощта на софтуера Layout Designer (CustomArray, САЩ). За потребителския микрочип използвахме оригинални последователности на олигонуклеотидни сонди на платформата Illumina HT 12 v4.

Подготовка и хибридизация на библиотеката

Пълният комплект за усилване на транскриптома WTA2 Kit (Sigma) е използван за обратна транскрипция и усилване на библиотеката. Протоколът на производителя беше модифициран чрез добавяне към реакцията на усилване dNTP смес, съдържаща биотинилиран dUTP, което доведе до окончателно съотношение dTTP/биотин-dUTP като 5/1. Хибридизацията на микрочипове се извършва съгласно протокола за хибридизация и откриване CustomArray ElectraSense ™. Хибридизационният микс съдържа 2,5 μg етикетирана ДНК библиотека, 6X SSPE, 0,05% Tween-20, 20 mM EDTA, 5x разтвор на Денхард, 100 ng/μl ултразвукова телешка тимусна gDNA, 0,05% SDS. Хибридизационната смес се инкубира с чип за една нощ при 50 ° С. Ефективността на хибридизацията е открита електрохимично с помощта на комплекта за откриване CustomArray ElectraSense ™ и четеца ElectraSense ™ 4X2K/12K.

Статистически анализ

P-стойностите бяха изчислени с помощта на теста на Mann-Whitney или сдвоения t-тест на Student по R (R: Проектът R за статистически изчисления). Кутиите на боксовите парцели представляват медианата с 25% и 75% процентили, долната мустачка е минималната стойност, горната мустака е максималната стойност, а отклоненията са нанесени като петна. Височините на парцела са средствата със стандартни отклонения на грешките. Статистическите анализи бяха програмирани в R, използвайки Rstudio soft.

Резултати

ALA влияние върху съдържанието на MeOH и FA в кръвта на мишки

Използвахме експериментален подход, при който на мишки се прилага ALA едновременно с 4-MP и показва, че приложението на ALA (20 mg/kg) и 4-MP (10 mg/kg) води до статистически значимо намаляване на MeOH (Фигура ( Фигура 1А) 1А) и съдържание на ФА (Фигура (Б1) 1В) в кръвта. Прилагането на Alda-1, активатор на ALDH2 (Chen et al., 2008; Perez-Miller et al., 2010), също понижава FA в кръвта на мишки (Фигура (Фигура 1C). 1C). Резултатите повдигат въпроси относно механизма на действие на ALA върху метаболизма на MeOH и FA. Тъй като ALA е многофункционален природен агент с антиоксидантни свойства (Fujita et al., 2008; Kamarudin et al., 2014; Shi et al., 2016), тествахме аскорбинова киселина и токоферол, известни природни антиоксиданти (Halliwell, 2006), за способността им да влияят на метаболизма на MeOH и FA при мишки. Изненадващо няма разлика в серумните нива на MeOH и FA между мишките, третирани с аскорбинова киселина (200 mg/kg) или токоферол (100 mg/kg) и контролните групи (Фигура S1).

Популярен

Те четат сега