Резюме

Заден план

Високият хранителен прием на зеленчукови продукти е полезен срещу затлъстяването и свързаните с него заболявания като дислипидемия, неалкохолна мастна чернодробна болест и рак. Преди това разработихме диетичен модел на затлъстяване на зебрафи (DIO-zebrafish), който развива висцерално затлъстяване, дислипидемия и чернодробна стеатоза. Зебрата е многофажно животно; по този начин предположихме, че DIO-зебра може да се използва за транскриптомен анализ на ефектите срещу затлъстяването на зеленчуците.

Резултати

Всеки зеленчук проявява различни ефекти срещу затлъстяването. Фокусирахме се върху домат "Campari", който потискаше повишаването на телесното тегло, плазмения TG и липидните капчици в черния дроб на DIO-зебра. Доматът Campari намаля srebf1 иРНК чрез увеличаване на foxo1 генна експресия, която може да зависи от високото съдържание на β-каротин в този щам.

Заключения

Доматът Campari подобрява затлъстяването, предизвикано от диетата, особено дислипидемия и чернодробна стеатоза чрез понижаване на регулацията на генната експресия, свързана с липогенезата. DIO-рибата зебра може да дискриминира ефектите срещу затлъстяването на различни щамове зеленчуци и ще се превърне в мощен инструмент за оценка на резултатите и намиране на нови механизми на ефектите от затлъстяването на природните продукти.

Заден план

Изградихме модел на затлъстяване, индуциран от диета, на зебра (DIO-зебра), прехранван с Артемия като диета с високо съдържание на мазнини [11]. Нарастването на телесното тегло, плазмения TG и чернодробната стеатоза, наблюдавани при този модел, са в голяма степен в съответствие със затлъстяването, наблюдавано при хора и модели на DIO при гризачи. Хистологичната конфигурация на прицелните органи на затлъстяване като черен дроб и висцерална мастна тъкан също е подобна [11, 12]. Освен това, основният профил на генна експресия на висцералната мазнина също е общ с човека [11]. Има няколко предимства в модела DIO-zebrafish. Отговорът на данио на Артемия е много добър; почти всички зебри, прехранени с тези организми, стават затлъстели, с повече хомогенност от моделите на гризачи. DIO-zebrafish е лесен за създаване и отнема само 2 седмици, за да предизвика затлъстяване. В допълнение, рибата зебра е многофажно животно, което позволява in vivo скрининг чрез орално приложение на тествани съединения. В нашето предварително проучване зебра може да погълне много видове зеленчуци, включително тиква, патладжан, краставица, зелен пипер и броколи, зърнени храни, включително ориз, и боб като смес от обикновена рибна храна, например Tetramin ®. По този начин зебрата може да се превърне в подходящ животински модел при експеримент за хранене, за да се оцени влиянието на хранителните състави срещу човешкото затлъстяване.

Методи

Етично одобрение

Разследването е в съответствие с етичните насоки, установени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Университета Ми.

Материали

Домати (щам Delica), тикви (щамове Ebisu и Kurimasaru) и яйчни растения (Choshi и Senryo) са закупени от Delica Foods (Токио, Япония). Тъй като щамът Delica е домат от червен тип, който е широко достъпен в японските супермаркети, ние го определихме като „обикновен“ домат. Доматите Campari са закупени от IDE Farm (наричан още Shio-Tomato, Кумамото, Япония). Снимките на тези зеленчуци са показани в допълнителен файл 1, фигура S1. Ликопенът (L9879) е закупен от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ)

Приготвяне на зеленчукови и ликопенсъдържащи рибни храни

Първо, всеки зеленчук се хомогенизира до течна фаза, използвайки стандартен смесител, предназначен за домашна употреба (MX-X37, National, Япония). Растителният сок се съхранява една нощ при -80 ° С. След това замразеният сок беше лиофилизиран (DC-400, YAMATO SCIENTIFIC, Япония). Когато сушенето завърши, към растителния прах бяха добавени същият обем (тегло) вода и търговска храна за люспи (Tetramin tropical flakes, Tetra, Германия) и смесени заедно, в резултат на което се получи смес, съдържаща 50% лиофилизиран зеленчуков прах. След това сместа се съхранява при -80 ° С и след това отново се лиофилизира. За да се получи ликопенсъдържаща рибна храна, ликопенът се суспендира в етанол и се смесва с тетрамин до крайна концентрация от 0,74 μg/ml. След изсушаване внимателно се смила на гранули (не на прах) с помощта на хаванче и пестик. За да се коригира размерът на гранулите, така че да е подходящ за консумация от възрастни рибки зебра, процесът на смилане се повтаря, докато всички гранули могат да преминат през сито с размер на окото от 700 μm. Гранулите се продухват с азотен газ, предпазват се от светлина и се съхраняват в аликвотни части при 4 ° С преди употреба. Като храна за контролна риба се използва тетрамин, хомогенизиран веднъж с вода и след това лиофилизиран.

Хранене на зебра и експериментален дизайн

Възрастни данио (AB, ZIRC, Eugene, OR, USA) се поддържат при 28 ° C при 14-часов светлинен: 10-часов тъмен цикъл и водните условия с качество на околната среда се поддържат в съответствие с Книга Zebrafish [13]. Zebrafish са разпределени във всяка диетична група за 2 или 4 седмици с 5 риби/1.7-L резервоар. Зебраните от групата за прехранване са били хранени три пъти на ден с Артемия (60 mg кисти/риба/ден; Miyako Kagaku, Токио, Япония). Зебраните от контролната група са били хранени веднъж дневно сутрин с Артемия (5 mg кисти/риба/ден) от 3,5 месеца след оплождането (mpf). Зебрафите са били хранени с растителна храна с люспи (2 mg/ден) 3 пъти по 20 минути преди това Артемия хранене по време на експерименти (Фигура 1А).

анти-мастното

Измерване на телесно тегло, плазмен TG и кръвна глюкоза

Телесното тегло и дължината на зебрата се измерват ежеседмично през цялото проучване. Дължината на зебрата се измерва от върха до края на тялото. За анализите на кръвната химия, рибите зебра са лишени от храна през нощта и кръвта е изтеглена от гръбната артерия чрез хепаринизирана стъклена капилярна игла (GD-1; Наришиге, Токио, Япония) в посочените часове. Кръвната глюкоза се определя с помощта на ръчен глюкомер (Glutest Neo, Sanwa Kagaku Kenkyusho, Nagoya, Япония). За определяне на плазмения TG кръвните проби се центрофугират в продължение на 3 минути при 3 500 об/мин при стайна температура и се събира плазмата; триглицеридите са измерени с помощта на комплект TG от тип Wako L (Wako Pure Chemical Industries, Токио, Япония) съгласно протокола на производителя.

Анализ на обема на хранене

Обем на хранене от Артемия се измерва ежеседмично през цялото проучване. Излюпено Артемия (5 или 60 mg кисти/риба/ден) се подава на зебра в 1.7-L аквариум, както е описано по-горе. За празен (без риба) контрол, Артемия е поставен в празен резервоар от 1,7 L без риба зебра (само вода за разплод). След 2 часа оставащите номера на Артемия които не са изядени от зебрата, са преброени три пъти и са извадени от тези в контролния резервоар за риба, за да се определи броя на храненето на Артемия във всеки резервоар.

Каротеноиди, съдържание на захар, аскорбинова киселина и NO3 - определяне

Измерване на активността на DPPH за отстраняване на радикалите на храни, съдържащи домати риба

Действията за отстраняване на радикалите на 1,1-дифенил-2-пикрилхидразил (DPPH) на рибни храни, съдържащи домати, се измерват по предварително докладван метод [21]. Накратко, част от суровия материал се разтваря в 200 μl EtOH, смесва се с 800 μl 100 mM Tris-HCl буфер (рН 7.4) и след това се добавя към 1 ml от 500 μM DPPH в EtOH. Сместа се разклаща енергично и се оставя за 20 минути при стайна температура на тъмно. Активността на DPPH за извличане на радикали на 60 μl проба от реакционната смес се определя с помощта на HPLC анализ с обърната фаза. Анализите бяха направени в колона TSKgel Octyl-80TsQA (4.6 × 250 min, Tosoh, Токио, Япония) при стайна температура с подвижна фаза на MeOH/H2O (7: 3, v/v) при скорост на потока 0.8 ml/мин. Пиковете се наблюдават с UV детектор, настроен на 517 nm. Процентното инхибиране на обезцветяването на DPPH от екстракта на пробата се изразява като еквиваленти на Trolox на 100 грама (μmol TE/100 g) [22].

Маслено червено O оцветяване

Чернодробните тъкани бяха събрани от риба зебра чрез хирургическа манипулация под стереоскопски микроскоп (MZ16F; Leica Microsystems, Wetzlar, Германия). Черният дроб се фиксира с помощта на 10% буфериран разтвор на формалин (Histo-Fresh; Pharma, Токио, Япония). Фиксираните проби се поставят в разтвор на захароза (Wako) при 4 ° C в продължение на 3 часа, след което бързо се замразяват в течен азотен охладен изопентан (Wako), вграден в Tissue-Tek (Sakura Finetek, Токио, Япония) и се дисектират чрез криостат Microm HM-550; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Секциите бяха потопени в работен разтвор на Oil Red O (Wako) за 15 минути и изплакнати с дестилирана вода, както е описано по-горе [23]. Секциите също бяха оцветени с хематоксилин на Майер (Wako), за да се визуализират ядрата съгласно протокола на производителя.

Анализ на ДНК микрочипове

Количествена RT-PCR

Общата РНК на всяка проба се пречиства, както е описано по-горе. СДНК от първа верига се приготвя с 500 ng обща РНК, като се използва система Super Script III с първа верига (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) със случаен праймер (Invitrogen). Количествената RT-PCR се извършва с Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) в три екземпляра, съгласно протокола на производителя. Последователностите на праймерите са показани в Допълнителен файл 2, Таблица S1. Данните бяха нормализирани по количеството актин бета (actb, NM_131031); това ни позволи да отчетем всяка променливост в началната концентрация на матрицата, както и ефективността на преобразуване на реакцията на обратна транскрипция.

Статистически анализ

Всички данни са представени като средно ± SEM. Разликите между 2 групи бяха изследвани за статистическа значимост от Student's т-тест. За множество сравнения се използва еднопосочна ANOVA, последвана от процедура за многократно сравнение Bonferroni-Dunn. A P-стойност

Резултати и дискусия

Доматът Campari проявява високи ефекти срещу затлъстяването при DIO-зебра

В сравнение с люспи, които също са били използвани за хранене на зебра [13], количествата мазнини и протеини в Артемия са съответно по-високи и по-ниски, докато количеството въглехидрати е сравнима [24]. Zebrafish хранени с 5 или 60 mg прясно излюпени Артемия дневно се консумира около 80% и 50% от предоставените Артемия, съответно, превеждайки съответно на 20 и 150 кал. Тъй като нуждите от енергия за поддръжка на зебра са Таблица 1 Каротеноиди, съдържание на захар, аскорбинова киселина и NO3 - определяне в Campari и обикновения домат

Анализ на транскриптома на черния дроб на DIO-зебра с домати

За да разкрием терапевтичния механизъм на домати Campari срещу чернодробна стеатоза, проведохме експерименти с ДНК микрочипове, използвайки чернодробни тъкани от тези зебрафи. При DIO-данио, хранени с домати Campari, експресията на 116 и 52 сонди се увеличава (> 1,3) и намалява (Таблица 2 QPCR на гени от биологични мрежи при третиране на домати Campari в сравнение с редовен щам

Анализ на пътя на черния дроб от лечението с домати Campari. Биологични мрежи, идентифицирани от IPA, използващи 90 човешки ортолога, променени при третирането на домати Campari. Интензивността на цвета на възела показва степента на регулиране (червено) и регулиране надолу (зелено). (А) Мрежа 1, свързана с липидния метаболизъм. (Б) Мрежа 2, също свързана с липидния метаболизъм. (В) Мрежа 3, свързана с компромис с рака. Резултатите от тези мрежи са описани в Таблица 2. Плътна стрелка, индукция и/или активиране; плътна линия без глава на стрелка, подвързване; пунктирана стрелка, потискане и/или инхибиране.

Заключения

Нашите наблюдения върху транскриптомните профили демонстрират мощно понижаващо липидите свойство на домати Campari при DIO-зебра чрез понижаване на регулацията на генната експресия, свързана с липогенезата. DIO-зебра може да дискриминира различните ефекти срещу затлъстяването на зеленчуците и може да се използва за идентифициране на механизми за действие срещу свързани със затлъстяването заболявания, особено мастна чернодробна болест. Това е първото проучване, което използва зебрафи за оценка на храната.

Информация за авторите

Toshiyuki Tainaka е директор в секцията за развитие на Delica Foods и аспирант в Медицински факултет на Университета Mie. Фокусът на изследването на г-н Тайнака е върху здравословната функция на зеленчуците.

Д-р Ясухито Шимада е преподавател в катедрата по молекулярна и клетъчна фармакология, фармакогеномика и фармакоинформатика, Висше училище по медицина, Университет Ми. Фокусът на изследването на д-р Шимада е изследване за предотвратяване на затлъстяване с помощта на диетичен модел на затлъстяване на риба зебра.

Д-р Юхей Нишимура е преподавател в Катедрата по молекулярна и клетъчна фармакология, фармакогеномика и фармакоинформатика, Висше училище по медицина, Университет Ми. Изследователските интереси на д-р Нишимура са биоинформатиката и фармакоинформатиката.

Доктор Норихио Нишимура е професор в Катедрата по транслационни медицински науки, Висше медицинско училище към Университета Ми. Изследователските интереси на д-р Нишимура са селскостопанската биотехнология и науката за храните.

Д-р Тошио Танака е професор в катедрата по молекулярна и клетъчна фармакология, фармакогеномика и фармакоинформатика, Висше училище по медицина, Университет Ми. Фокусът на изследването на д-р Танака е да идентифицира целите на лекарствата, използвайки фармакогеномичен подход. Д-р Танака е публикувал над 100 рецензирани научни статии и рецензии в международни списания.