Акупунктурата насърчава покафеняване на бялата мастна тъкан чрез индуциране на експресия на UCP1 върху DIO мишки

ibg.waykun.com - Диета и загуба на тегло, днес

Weixing Shen

Ключова лаборатория за акупунктура и изследвания на медицината към Министерството на образованието, Университет по китайска медицина в Нанкин, 210023 Нанкин, Китай

Ян Уанг

Шън-Фън Лу

Хао Хонг

Shuping Fu

Суюн Хе

Цян Ли

Jingxin Yue

Училище за информационни технологии, Университет по китайска медицина в Нанкин, 210023 Нанкин, Китай

Бин Сю

Бинг-Мей Жу

Резюме

Заден план

Да се изследва влиянието на акупунктурата и нейния възможен механизъм върху бялата мастна тъкан при затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини.

Методи

Четири седмични мишки C57BL/6 J бяха разделени на случаен принцип в група с нормален хранителен режим и група с високо съдържание на мазнини (HFD). След 8 седмици, HFD мишките бяха разделени на случаен принцип в група с електроакупунктура (EA) и контролна група. Мишките от групата на ЕА са били електроакупунктурирани, под физическо ограничение, върху акусантите на Zusanli (ST36) и Neiting (ST44), докато мишките от контролната група са били само под физическо ограничение. Проследява се телесното тегло и приема на храна и се измерват нивата на серумния лептин, холестерол и триглицериди с помощта на биохимични методи. Ефектът на EA върху белите мастни тъкани (WAT) се оценява чрез qPCR, имуноблотинг, имунохистохимия (IHC), експеримент за имунопреципитация и студена издръжливост.

Резултати

Съотношението WAT/телесно тегло намалява (P Keywords: Акупунктура, Браунинг, затлъстяване, UCP1, бяла мастна тъкан

Заден план

Затлъстяването е един от водещите глобални рискови фактори за здравето и е свързано с други здравословни проблеми, като захарен диабет тип 2, сърдечно-съдови заболявания и рак. При високорискови субекти намаляването на телесното тегло с 5-10% може да намали риска от диабет с 58% [1]. Съществуващите лекарства и терапии против затлъстяване са ограничени от странични ефекти, включително промени в настроението, мисли за самоубийство и стомашно-чревни или сърдечно-съдови усложнения, и не успяват да постигнат адекватен контрол на теглото при всички пациенти [2]. По този начин затлъстяването се превърна в съвременно медицинско предизвикателство.

В продължение на много години акупунктурата се използва за лечение на затлъстяване в Китай и е изследвана в клинични проучвания по целия свят [10–12]. Той осигурява безопасна и ефективна алтернативна терапия, като получава по-голямо приемане от пациентите със затлъстяване като избрано от тях лечение, както и признание както от Националните здравни институти, така и от СЗО. Механизмът, чрез който акупунктурата е насочена към затлъстяването, все още остава неясен.

Стимулирането с електро-акупунктура (EA) предизвиква ли WAT „покафеняване“? В настоящото проучване използвахме индуцирани от диета затлъстели мишки като животински модел и ги лекувахме с EA на акусантите на Zusanli (ST36) и Neiting (ST44). Нашето проучване за първи път разкри, че електроакупунктурното лечение може да предизвика експресия на UCP1 в WAT и да насърчи покафеняване на WAT.

Методи

Антитела и праймери

Антитела

Goatanti-UCP1 (Santa Cruz, Cat # sc-6528, разреждане 1: 500 за Western Blot); Заешки анти-Prdm16 (Abcam, Cat # ab106410, разреждане 1: 1000 за Western Blot); Заешки анти-SirT1 (Abcam, Cat # ab32441, разреждане 1: 1000 за Western Blot); Заешки анти-GAPDH (клетъчна сигнализация, Cat # 2118, разреждане 1: 2000 за Western Blot); Заешки анти-Pparγ за вестерн-блот (клетъчно сигнализиране, Cat # 2443, разреждане 1: 1000 за Western Blot); Мишка против Pparγ за имунопреципитация (Санта Круз, Cat # sc-7273); Mose анти-ацетил-лицин (клетъчна сигнализация, Cat # 05-515, разреждане 1: 1000 за Western Blot).

Грундове

Грундовете са проектирани с помощта на софтуера Primer 5.0. UCP1 (напред: 5′-TGGAAAGGGACGACCCCTAA-3 ′, реверс: 5′-CAGGAGTGTGGTGCAAAACC-3 ′), Prdm16 (Напред: 5′-CTTAGCCGGGAAGTCACAGG-3 ′, Реверс: 5′-CCTCAACGACTAC 5′-GTCACACTCTGACAGGAGCCCC-3 ′, реверс: 5′-CACCGCTTCTTTCAAATCTTGT-3 ′), GAPDH (напред: 5′-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3 ′, реверс: 5′-CAGGGATGATGCA-TGTTCTG G 3G).

Животни и групиране

Четириседмични мишки C57BL/6J (n = 100) бяха доставени от Експерименталния център за животни към Университета на Китайската медицина в Нанкин и бяха разделени на случаен принцип в група с нормална диета (NF, n = 20) и група с висока диета ( HDF, n = 80). Мишките от групата на NF са били хранени с нормална диета, а мишките от групата на HDF са били хранени с D12451 Diet Diet с 45 kcal% мазнини (закупени от Shanghai SLAC Laboratory animal Co. Ltd). Мишките се претеглят всяка седмица след гладуване в продължение на осем часа. След осем седмици затлъстелите мишки се определят чрез 20% увеличение на телесното тегло в сравнение с NF мишките и след това се разделят на случаен принцип в контролна група и електро-акупунктурна група (EA). Изследването е одобрено от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Университета по китайска медицина в Нанкин и всички процедури са проведени в съответствие с указанията на Националния комитет по здравеопазване и употреба на животните.

Електро-акупунктурна интервенция

Мишките от групата на ЕА са били физически задържани, след това са електроакупунктурирани на Zusanli (ST36) и Neiting (ST44), докато мишките от контролната група са били задържани по същия начин, без акупунктура. За EA мишките, две акупунктурни игли (Gauge-28, 0,5 cm) бяха вкарани поотделно във всяка акупунктура и към иглите беше подаден електрически ток чрез електрически стимулатор с параметри 2/15 Hz при ниво на интензитет 1 mA ( Han Acuten, WQ1002F, Пекин, Китай) за 30 минути, веднъж на ден, шест дни в седмицата. Теглото на мишките и консумацията на храна се наблюдават всяка седмица. След 4 седмици лечение с ЕА, всички мишки бяха умъртвени с CO2 и пробите бяха събрани.

qPCR анализ

Общата РНК беше изолирана, използвайки TRIzol® Reagent (Invitrogen, Cat # 15596-026), съгласно препоръките на производителя. Концентрациите на РНК се определят количествено и се транскрибират обратно, като се използва ThermoScript ™ RT-PCR система за първи верижен кДНК синтез (Invitrogen, Cat # 11146-016). Генните експресии бяха открити с помощта на GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Cat # A6001) в Strata ген MX3000P в реално време PCR система (Genetimes, Китай). Относителните нива на генна експресия бяха изчислени чрез △△ Ct и сравнени с GAPDH като вътрешен контрол.

Имуноблотинг

Пробите в SDS буфер за зареждане се нагряват (100 ° C, 5 минути), подлагат се на SDS-PAGE, прехвърлят се в PVDF или нитроцелулозни мембрани и се блокират (4 ° C, за една нощ) в PBST (PBS с 0,05% Tween 20), съдържащи 5 % обезмаслено сухо мляко или 5% BSA. Петната бяха инкубирани с първично антитяло в блокиращ буфер (за една нощ, 4 ° С) и след това с второ антитяло (1: 1000

2000 разреждане, 1 h, RT). Сигналите бяха открити с помощта на SuperSignal® West Femto Maximum Sensitive Substrate. Използва се имунодетекция на ендогенен GAPDH, за да се покаже, че еквивалентни количества протеин присъстват в проби, добавени към SDS PAGE (ямки/платна, μg/L).

Имунопреципитация

Епидидималната мастна тъкан на плъхове се хомогенизира в ледено студен буфер, съдържащ 10% глицерол с mmol/L 50 HEPES, 100 натриев пирофосфат, 100 натриев флуорид, 1 EDTA, 1X протеазен инхибиторен коктейл (Sigma, Cat # P8340) и 1% Triton X -100 или 1% NP-40. Неразтворимият материал се отстранява чрез центрофугиране (100 000 g, 30 минути, 4 ° С). Предварително изчистените лизати (500 μg) се инкубират (в продължение на една нощ, 4 ° C) с 2 μg анти-Pparγ (Santa Cruz). Добавени са протеинови G мъниста; След инкубиране в продължение на 2 часа при 4 ° С, топчетата се центрофугират (2000 g, 30 s), промиват се 5 пъти с ледено буфер за лизис и се нагряват в 1 × SDS буфер за проба, съдържащ 5% β-меркаптоетанол при 95 ° C за 5 минути, за да се освободи свързан протеин. Елуатите се подлагат на SDS-PAGE за Western blot.

Откриване на Elisa на нивата на серумния лептин, холестерол и триглицериди

Комплектът Elisa е закупен от ShangHaiQiaDu Biotechnology CO.LTD, лептин (Cat # QD20613), холестерол (Cat # QD20142) и триглицерид (Cat # QD20195). Нивото на серума беше открито в съответствие с препоръките на производителя. Накратко, стандарти и всеки 40 μl мишки серум бяха добавени в 96 добре покрита плака с 10 μl белязано с биотин антитяло, инкубирано при 37 ° С в продължение на 30 минути и последвано с 5 пъти измиване, след което инкубирано с HRP-конюгат реагент за 60 минути при 37 ° С. Измива се 5 пъти, след това се добавя разтвор на хромоген A 50 μl и разтвор на хромоген B, избягва се запазването на светлината за 15 минути при 37 ° C, добавят се 50 μl стоп разтвор, стойности на OD се откриват при 450 nm с помощта на Multiskan FC (Thermo Scientific, САЩ). Количеството лептин, холестерол и триглицериди се определя количествено чрез стандартна крива.

Хистологичен анализ и имунофлуоресцентно оцветяване

Мастната тъкан се фиксира с 4% формалин и се вгражда с парафин, нарязва се на участъци с дебелина 25 μm върху стъкла, депарафинира се в ксилен (5 × 4 минути) и се хидратира (100%, 95% и 75% етанол) за 2 × 3 минути всеки. Слайдовете се нагряват в микровълнова печка в продължение на 3 × 5 минути в целевия разтвор за извличане на антиген (Dako), охлаждат се до стайна температура, измиват се в PBS (3x5 минути) и се блокират и проникват в 10% магарешки серум, съдържащ 0% тритон X- 100 за 6 часа при 4 ° С. Слайдовете бяха инкубирани в блокиращ буфер с първично антитяло за една нощ и измити с PBS (3 × 5 минути) преди инкубиране в блокиращ буфер в продължение на два часа с вторични антитела (Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 594) (Молекулярни сонди). Слайдовете бяха разгледани с флуоресцентен микроскоп (Nikon TE2000, Япония).

Експеримент със студена издръжливост на мишки

Мишките бяха оставени в клетката си без никакви подложки, храна и вода в студена стая с 4 ° C. Ректалните температури бяха открити с помощта на електро-термометър (TH212, Hongauchengyun Co. Ltd., Китай) на всеки три часа.

Статистика

Данните бяха представени като средни стойности ± стандартно отклонение (SD). Статистическият анализ беше извършен с помощта на SPSS 18.0; множество групови сравнения бяха направени от ANOVA и две групови сравнения бяха определени с помощта на несдвоен двустранен t тест на Student. P 1 A, A, 1B), 1 B), дори след пет седмици интервенция. През първите три седмици от лечението мишките както в ЕА, така и в контролната група показаха намаление на апетита, което обаче започна да намалява до петата седмица от лечението при контролни мишки, но продължи да нараства при ЕА мишки, което предполага, че електроакупунктурата повишен апетит при тези мишки до известна степен.

Електроакупунктурна индуцирана експресия на UCP1 насърчава WAT покафеняване

Генът за несвързване на протеин 1 (UCP1) обикновено се експресира конкретно в кафява мастна тъкан (НДНТ) и се счита за НДНТ маркер. В това проучване, след петседмично лечение с електроакупунктура, WAT при EA мишки изглеждаше значително по-тъмен в сравнение с този при нетретираните контролни мишки (Фигура 2 В), което намекна, че електроакупунктурата може да стимулира WAT да се промени на BAT . Също така открихме, че експресията на гена на UCP1 в WAT е увеличила почти 14 пъти при EA мишки, отколкото при контролните мишки (Фигура 2 A), а експресията на UCP1 протеин също значително се е увеличила при EA мишки (Фигура 2 B). Нашите данни категорично предполагат, че електроакупунктурното лечение води до покафеняване на WAT при EA мишки. Тъй като UCP1 е отговорен главно за термогенните действия и липидната мобилизация при бозайници, ние анализирахме размера на адипоцитите чрез имунохистохимия и наблюдавахме очевидно по-малък размер на WAT при мишки EA в сравнение с контролните мишки и нормалните хранителни мишки (Фигура 2 D), което предполага, че електро- лечението с акупунктура може да насърчи липолиза при мишки със затлъстяване.

Електроакупунктурата насърчава покафеняване на бялата мастна тъкан чрез индукция на експресия на UCP1 при DIO мишки. (А) mRNA на експресия на UCP1 в Epi-WAR се открива чрез qPCR. Данните бяха изразени като средни стойности ± SD, n = 16 във всяка група, * P 3 D), което предполага, че EA мишките са по-способни да понасят студената стимулация, в сравнение с контролните мишки. В комбинация с данните за експресията на UCP1, нашите резултати предполагат, че покафеняването на WAT в мишките EA може да е отговорно за генерирането на повече топлина за поддържане на телесната температура.

Лечението с електроакупунктура промени генетичната експресия, свързана с BAT и ацетилирането на Pparγ в WAT

Транскрипцията на UCP1 се регулира от поредица молекулярни механизми, в които участват Pparγ, SirT1 и Prdm16. Установихме, че генната експресия на Pparγ се увеличава 1,5 пъти в WAT на EA мишки, отколкото при контролните мишки (Фигура 4 A), въпреки че нивото на протеина му не се променя (Фигура 4 D), но ацетилирането на Pparγ очевидно е намалено в EA мишки след електроакупунктурно лечение (Фигура 4 Д). Prdm16, който е коактиватор на Pparγ, регулиращ UCP1 транскрипция, не показва никаква разлика в нивата на експресия между EA и контролните групи (Фигура 4 D). SirT1, който кодира протеина Sirt1 и регулира експресията на UCP1 чрез хистоново деацетилиране [7], беше повишен на ниво протеин в групата на ЕА (Фигура 4 D). Не е изненадващо, че генната експресия на други два специфични BAT маркера, COX4il (Фигура 4 B) и Nrbf1 (Фигура 4 C), нараства значително в WAT на EA мишки, в сравнение с тази на контролните мишки. Тези данни потвърдиха за пореден път, че електро-акупунктурата насърчава WAT покафеняване.

Заключения

Взети заедно, нашите резултати първо дадоха експерименталните доказателства, че EA може да реконструира WAT към BAT чрез индуциране на експресия на UCP1 и това може да е един от механизмите, чрез които акупунктурата влияе върху загубата на тегло.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от Националната програма за основни изследвания на Китай (програма 973, Grand No.2012CB518501), Националната фондация за естествени науки на Китай (грант № 81273838, 81303018, 81303019), Националната фондация за природни науки на колежи и университети в Дзянсу ( Грант № 11KJA360003), Университета в Нанкин на TCM (Гранд № YS2012ZTX411). Благодарим и на WX LIU (Университет на Пенсилвания, Училище по ветеринарна медицина) за редактиране на английски език.

Популярен

Те четат сега