Роли Куриране на данни, разследване, методология, валидиране

сърце

Афилиации Химически факултет, М.В. Московски държавен университет "Ломоносов", Москва, Русия, Център за сърдечно-съдова хирургия "Бакулев", Москва, Русия

Роли Формален анализ, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Афилиации Химически факултет, М.В. Московски държавен университет "Ломоносов", Москва, Русия, Център за сърдечно-съдова хирургия "Бакулев", Москва, Русия

Роли Куриране на данни, разследване, валидиране

Афилиации Химически факултет, М.В. Московски държавен университет "Ломоносов", Москва, Русия, Център за сърдечно-съдова хирургия "Бакулев", Москва, Русия

Роли Концептуализация, администриране на проекти, ресурси, надзор

Принадлежност Бакулев Център за сърдечно-съдова хирургия, Москва, Русия

Роли Куриране на данни, Ресурси

Принадлежност Бакулев Център за сърдечно-съдова хирургия, Москва, Русия

Роли Куриране на данни, Ресурси

Принадлежност Бакулев Център за сърдечно-съдова хирургия, Москва, Русия

Принадлежност Бакулев Център за сърдечно-съдова хирургия, Москва, Русия

Роли Формален анализ, придобиване на финансиране, ресурси

Affiliation University of Arizona Health Sciences, Tucson, Arizona, Съединени американски щати

Концептуализация на роли, Куриране на данни, Формален анализ, Придобиване на финансиране, Разследване, Методология, Администриране на проекти, Надзор, Утвърждаване, Писане - оригинален проект, Писане - преглед и редактиране

Принадлежности Университет на Аризона Здравни науки, Тусон, Аризона, Съединени американски щати, Катедра по анестезиология, Университет на Илинойс в Чикаго, Чикаго, Илинойс, Съединени американски щати

  • Виктория Е. Тихомирова,
  • Олга А. Кост,
  • Олга В. Крюкова,
  • Елена З. Голухова,
  • Найда И. Булаева,
  • Айгерим З. Жолбаева,
  • Лео А. Бокерия,
  • Джо Г. Н. Гарсия,
  • Сергей М. Данилов

Фигури

Резюме

Ангиотензин-конвертиращият ензим (АСЕ), който метаболизира много пептиди и играе ключова роля в регулирането на кръвното налягане и ремоделирането на съдовете, се изразява като мембранен гликопротеин тип 1 на повърхността на различни клетки, включително ендотелни клетки на сърцето. Ние предположихме, че локалната конформация и следователно свойствата на сърдечната АСЕ могат да се различават от белодробните АСЕ поради различна микросреда в тези органи.

Методи и резултати

Извършихме ACE фенотипиране (нива на ACE, конформация и кинетични характеристики) в човешкото сърце и го сравнихме с това в белия дроб. Активността на АСЕ в сърдечните тъкани е с 10–15 по-ниска от тази в белите дробове. Показано е, че различни ACE ефектори, LMW ендогенни ACE инхибитори и HMW ACE-свързващи партньори присъстват както в сърдечните, така и в белодробните тъкани. „Конформационен пръстов отпечатък“ на сърдечен АСЕ (т.е. моделът на 17 mAbs, свързващ се с различни епитопи на повърхността на АСЕ), значително се различава от този на белодробния АСЕ, което отразява различията в локалните конформации на тези АСЕ, вероятно контролирани от различно АСЕ гликозилиране в тези органи. Субстратната специфичност и рН-оптимите на сърдечните и белодробните АСЕ също се различават. Освен това, дори в сърцето очевидните ACE дейности, локалните ACE конформации и съдържанието на ACE инхибитори се различават в предсърдията и вентрикулите.

Заключения

Значителни разлики в локалните конформации и кинетичните свойства на АСЕ на сърцето и белите дробове демонстрират тъканна специфичност на АСЕ и осигуряват структурна основа за развитието на mAbs, способни да разграничат сърдечни и белодробни АСЕ като потенциален кръвен тест за прогнозиране на риска от предсърдно мъждене.

Цитат: Тихомирова В.Е., Кост О.А., Крюкова О.В., Голухова Е.З., Булаева Н.И., Жолбаева А.З. и др. (2017) ACE фенотипизиране в човешкото сърце. PLoS ONE 12 (8): e0181976. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181976

Редактор: Michael Bader, Max Delbruck Centrum fur Molekulare Medizin Berlin Buch, ГЕРМАНИЯ

Получено: 17 април 2017 г .; Прието: 10 юли 2017 г .; Публикувано: 3 август 2017 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Министерството на науката и образованието на Руската федерация [грант номер 14.Z50.31.0026].

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Съкращения: АСЕ, ангиотензин-конвертиращ ензим; AF, предсърдно мъждене; FA-, фуранакрилоил-; HHL (Hip-His-Leu), хипурил-L-хистидил-L-левцин; HMW, високо молекулно тегло; LMW, ниско молекулно тегло; PTM, пост транслационни модификации; RAS, ренин-ангиотензинова система; ZPHL (Z-Phe-His-Leu), карбобензокси-L-фенилаланил-L-хистидил-L-левцин

Въведение

Предсърдно мъждене (AF) е най-честата сърдечна аритмия, причиняваща значителна сърдечно-съдова заболеваемост и смъртност [1]. Въпреки че са описани рискови фактори, няма налични кръвни тестове за прогнозиране на риска от AF.

Активирането на ренин-ангиотензиновата система (RAS) окончателно играе важна роля в патогенезата на предсърдно мъждене [2–4]. Ангиотензин II е основен медиатор на RAS, който се произвежда главно от ангиотензин I чрез ангиотензин-конвертиращ ензим (ACE, EC 3.4.15.1, CD143). Известно е, че пациентите с AF имат повишено ниво на експресия на АСЕ в сърдечната тъкан, по-специално в предсърдията [2]. Изследване върху трансгенните мишки също демонстрира, че повишената експресия на АСЕ в сърцето може да бъде причиняващ фактор за ПМ и внезапна сърдечна смърт [5]. Както ACE инхибиторите, така и блокерите на ангиотензиновите рецептори намаляват честотата на AF и могат да предотвратят свързани с AF усложнения при пациенти и в експериментални модели [3].

ACE е Zn 2+ пептидилдипептидаза, която играе ключова роля в регулирането на кръвното налягане чрез производство на ангиотензин II и разграждане на брадикинин и в развитието на съдовите, включително сърдечни, патология и ремоделиране. АСЕ се експресира конститутивно на повърхността на ендотелните и някои епителни клетки, както и клетките на имунната система (макрофаги, дендритни клетки), прегледани в [6,7]. Експресията на АСЕ в нормалните и патологични човешки сърца е проучена по-рано [8,9]. Към днешна дата са идентифицирани няколко нови субстрата за АСЕ (AcSDKP, ангиотензин 1–7) и са предложени нови функции за АСЕ, като външна сигнализация в клетките, представяне на антиген [10–12]. Антифиброзните и противовъзпалителни действия на субстрат за АСЕ, AcSDKP, изглеждат особено важни за патогенезата на ФП при пациенти с повишено ниво на АСЕ в сърцето [13].

Въпреки силната връзка на активирането на RAS с аритмии, плазмените нива на ACE не корелират с AF и камерни аритмии. По принцип плазменият АСЕ отразява точно нивото на АСЕ в тъканите [14]. АСЕ в кръвта произхожда от ендотелни клетки, предимно белодробни капиляри, които проявяват близо 100% експресия на АСЕ в сравнение с само 5–15% АСЕ-положителни капиляри в системното кръвообращение [15]. Въз основа на това, ние изчислихме, че ACE, отделен от сърдечните капиляри, може да представлява не повече от 1% от общия ACE в кръвта. Ето защо общото ниво на АСЕ в плазмата при пациенти не изглежда да е предсказващ параметър за пациенти с ПМ. Тъй като обаче предсърдното АСЕ се увеличава 3 пъти при пациенти с АФ [2], количественото определяне на определените от сърцето АСЕ (главно АТЕ, получени от предсърдията) в плазмата теоретично може да се използва като предсказващ тест за риска от ФП.

Доказахме концепцията, че конформацията на АСЕ е специфична за клетките и тъканите и произтича вероятно от различно гликозилиране на ензима на примера на АСЕ от белодробни ендотелни клетки спрямо АСЕ от макрофаги и дендритни клетки на саркоиден гранулом [16] и АСЕ от епителни клетки на простатата [17]. ACE конформационният пръстов отпечатък, основан на модела на свързване на набор от mAbs с различни епитопи на повърхността на ACE [16], има следователно потенциал за разкриване на клетките/органите, от които произхожда ACE.

Приложихме този подход тук, за да демонстрираме конформационни различия на АСЕ, произхождащи от човешко сърце и белия дроб, и показахме разлики за пречистени АСЕ, за АСЕ в тъканни хомогенати и АСЕ в кръвта след in vivo перфузия. Ние вярваме, че такива разлики ще позволят генерирането на моноклонални антитела (mAbs), способни да различават АСЕ, отделяни за кръвообращението от тези два органа и следователно да формират основата за кръвен тест за прогнозиране на риска от AF.

Експериментална секция

ACE от различни източници

Работата е извършена в съответствие с Етичния кодекс на Световната медицинска асоциация (Декларация от Хелзинки) и е одобрена от Институционалните съвети за преглед на Центъра за сърдечно-съдова хирургия Бакулев, Московския държавен университет и Университета на Илинойс в Чикаго. Никой от дарителите не е от уязвимите групи и всички дарители или близки роднини са предоставили писмено информирано съгласие, което е дадено свободно. Човешки цитрирани плазмени и тъканни хомогенати (1: 9 и, в някои случаи, съотношение 1: 3 w/v) от 10 донори (петима мъже донори, възраст 54–66 и пет жени донори, на възраст 28–68), включително донори с предсърдно мъждене, са използвани като източници на соматични АСЕ. Белодробните и сърдечните ACE бяха пречистени от тъканни хомогенати с помощта на анионообменна хроматография на DEAE-Toyopearl 650M и след това афинитетна хроматография на лизиноприл - както в [18] „S1 Table“. Доказано е, че пречистените АСЕ препарати са хомогенни чрез електрофореза в 7,5% SDS-PAGE “S1 Фиг.”.

Анализ на активността на АСЕ

Активността на АСЕ в кръвната плазма, хомогенатите на човешки органи или хомогенатите на сърдечните камери беше измерена с помощта на флуориметричен анализ с два АСЕ субстрата, 2 mM Z-Phe-His-Leu (ZPHL) и 5 ​​mM Hip-His-Leu (HHL) [ 19]. Инхибирането на ACE активността с антикаталитичен mAb 5F1 към N домейн на ACE и mAb 1E10 към C домейн се извършва при концентрации на mAbs 100 μg/μl и 10 μg/μl, съответно, с 1mM ZPHL или 2.5 mM HHL като субстрати.

Субстратна специфичност на ACE

Кинетичните параметри на хидролизата на няколко синтетични трипептидни субстрата и естествен субстрат декапептид ангиотензин I чрез пречистени човешки АСЕ на сърцето и белите дробове бяха определени в 0,05 М фосфатен буфер, рН 7,5, съдържащ 0,15 М NaCl и 1 μM ZnCl2, при 25 ° C. Скоростите на ензимна хидролиза на Z-Phe-His-Leu, Hip-His-Leu и ангиотензин I се определят флуориметрично, докато кинетиката на хидролизата на FA-съдържащи субстрати FA-Phe-Gly-Gly и FA-Phe Phe-Arg, беше изследван спектрофотометрично [20].

Имунологична характеристика на АСЕ (плоча имунопреципитационен анализ)

Деветдесет платки с шест ямки (Corning, Corning, NY) бяха покрити с анти-ACE mAbs чрез кози анти-миши IgG (Pierce, Rockford, IL) мост [21] и инкубирани с различни източници на ACE, които бяха уравновесени за ACE активност . След измиване на несвързания АСЕ, свързаната с плочи АСЕ активност беше измерена чрез добавяне на субстрат за АСЕ, Z-Phe-His-Leu, директно в кладенците [21]. Шестнадесет mAb върху човешки ACE са генерирани в нашата лаборатория [16], докато mAb BB9 е любезно предоставен от Paul J. Simmons (тогава Фондация Браун на молекулярната медицина, Център за здравни науки на Университета на Тексас, Хюстън, Тексас, САЩ).

Диализа и филтриране на човешка плазма и хомогенати на сърцето и белите дробове

Диализа на сърдечни и белодробни хомогенати се извършва в диализни касети с 10 kDa (Pierce, Rockford, IL) и в 100 kDa Biotech диализни епруветки (Spectrum Inc., Houston, TX) срещу 0,05 фосфатен буфер, pH 7,5, 0,15 M NaCl и μM ZnCl2, при 4 ° C. Филтрацията на хомогенатите се извършва върху Vivaspin филтриращи мембрани (GE Healthcare, Sartorius Corp., Bohemia, NY) с граници 30 kDa и 100 kDa при 12 000 g.

Аминопептидазна активност

Активността на аминопептидазата в тъканните хомогенати при различни разреждания се оценява чрез скоростите на хидролиза от 0,01–0,1 mM His-Leu в буфер PBS-BSA, рН 8,3, при 37 ° C.

ACE перфузия при плъхове

Всички in vivo методи/експерименти с плъхове са одобрени и проведени в съответствие с насоките и разпоредбите на Комитета по етика на опитите върху животни на Московския държавен университет, които съответстват на насоките на NIH (Ръководство за грижа и използване на лабораторни животни). Възрастни мъжки плъхове Wistar с тегло

300 g бяха поставени в състояние без патогени в отделни пластмасови клетки с дървени стърготини в климатизирана стая при постоянна температура (23 ± 1 ° C) и 70% влажност. Плъховете бяха снабдени с вода и стандартна диета (LabDiet, 5053 (LabDiet; Сейнт Луис, МО, САЩ)) ad libitum. Всички животни са били наблюдавани ежедневно за здравето на тялото в продължение на една седмица преди експеримент. Всички усилия бяха положени за минимизиране на страдащите плъхове. Пречистените ACE на човешкото сърце и белите дробове, 1000 mU в 100 μl, рН 7,4, се инжектират в опашната вена на плъхове (два плъха на група) с анестезия с кетопрофен. След 30 минути се извършва евтаназия чрез обезглавяване, кръвта се събира и се приготвя цитратна плазма. По това време около 30% от човешкия АСЕ все още е в кръвта на плъхове. Утаяването на човешки ACE от плазмата на плъхове чрез набор от mAbs към ACE се извършва, както е описано по-горе, но се коригира за следи от утаяване на ACE от плъхове от тези mAbs.

Статистически анализ

Всички данни са средни ± SEM. Значимостта беше анализирана с помощта на теста на Ман-Уитни със STATISTICA 6 (StatSoft, Inc., ОК).

Резултати и дискусия

АСЕ активност в човешкото сърце

Оценихме експресията на АСЕ в различни човешки тъкани, а именно сърце, бял дроб, бъбреци и далак, чрез сравняване на АСЕ активността в хомогенати на тези тъкани, както и в цитрирана плазма на човека. АСЕ активността в човешкия сърдечен хомогенат (изразена в mU на грам тъкан) е около 3 пъти повече, отколкото в човешката плазма и 8-12 пъти по-малка, отколкото в човешкия бял дроб (Фигура 1). Тази оценка корелира с плътността на местата на свързване на АСЕ инхибитора на радиолиганда в човешкото сърце и белия дроб [22], както и с високата транскрипция на АСЕ РНК в белия дроб, макар и незначителна в сърцето, както в Атласа на човешки протеин [23].

Активността на АСЕ в тъканни хомогенати от 10 донори и цитрирана плазма се определя количествено, като се използва спектрофлуориметричен анализ с 2 mM ZPHL и 5 mM HHL като субстрати. Хомогенатите се приготвят в съотношение 1: 9 (тегло/обем) и се разреждат допълнително 1/10, за да се сведе до минимум ефектът от предполагаемите ендогенни АСЕ инхибитори и LMW АСЕ ефектори. Плазмата се разрежда 1: 4 с PBS. Данните са изразени като mU на грам тъкан (за хомогенати) или на ml неразредена плазма, p Фигура 2. Ефект на разреждането върху видимата активност на АСЕ в сърцето и белодробните хомогенати.

Активността на АСЕ се измерва в хомогенатите на сърцето и белите дробове от 10 донори при различни разреждания, като се използват два субстрата, ZPHL и HHL (както е в легендата към фигура 1). Данните са изразени като% от активността на АСЕ в неразредени хомогенати (А, Б), както и% от съотношението ZPHL/HHL от това за неразредените хомогенати (° С,д). Всяка стойност е средна стойност на няколко (2-3) експеримента в дубликати, p Фигура 3. Конформационни характеристики на различни ACE.

Конформационните пръстови отпечатъци на сърдечни и белодробни АСЕ бяха извършени с набор от 17 mAbs на двудоменния АСЕ. Имунопреципитирана АСЕ активност от пречистени разтвори на АСЕ (A), тъканни хомогенати от 10 донори (Б.) или ACE след перфузия в кръвообращението на плъхове (° С) са представени като% („съотношение на свързване“) за сърдечна АСЕ от тази на белодробната АСЕ. Съотношенията, увеличени с повече от 20%, са подчертани в оранжево, повече от 50% в тъмно оранжево и повече от 200% в червено, докато намалените повече от 20% са подчертани в жълто и повече от 50% в тъмно синьо. Данните са средни ± SD от поне 3 експеримента (всеки в дубликати), p Фигура 4. АСЕ ефектори в сърдечната и белодробната тъкан.

Конформационният пръстови отпечатък на сърдечни и белодробни АСЕ е извършен с набор от 17 mAbs към АСЕ, както е в легендата към Фигура 3. Имунопреципитирана АСЕ активност след пречистване на АСЕ на сърцето и белите дробове чрез анионообмен и афинитетна хроматографияА, Б), след диализа (C, D) и филтриране през филтър с граница 100 kDa (E, F) се представя като% („съотношение на свързване“) от имунопреципитираната АСЕ активност от родителските хомогенати. Съотношенията, увеличени с повече от 20%, са подчертани в оранжево, повече от 50% в тъмно оранжево и повече от 100% в червено. Съотношенията, намалени с повече от 20%, са подчертани в жълто, повече от 50% в наситено синьо. Данните са средни ± SD на 2-3 експеримента (всеки в дубликати), p Фигура 5. Зависимост на активността на АСЕ от рН.

Анализите на активността на пречистените сърдечни и белодробни АСЕ спрямо 0,5 mM Z-Phe-His-Leu (A) и 1,3 mM Hip-His-Leu (Б.) се извършват в 25 mM ацетат-MES-трис-боратен буфер, съдържащ 0,15 M NaCl и 1 μM ZnCl2. Всяка стойност е средно за няколко (2-3) експеримента в дубликати.

Инхибиторният ефект на антикаталитичния mAb 5F1 [21] към N домена и mAbs 1E10 и 4E3 към C домена [36], докато тези mAbs по различен начин се свързват със сърдечните и белодробните ACE (Фигура 3A и 3B), не показват, обаче, значителна разлика в степента на инхибиране на тези две АСЕ (не е показано).

Кинетичните параметри, kcat и Km, на хидролизата на няколко синтетични субстрата, както и естествен субстрат ангиотензин I, чрез пречистени сърдечни и белодробни АСЕ са представени в таблица 1. Две от субстратите, Z-Phe-His-Leu и Hip-His-Leu, са С-терминални аналози на ангиотензин I, докато субстрат с Phe-Arg на неговия С-край може да се разглежда като С-краен аналог на друг естествен АСЕ субстрат, брадикинин, както и С-терминал аналог на атриопептин 2.