• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: aagarwal @ ncbs.res.indagashe @ ncbs.res.in

РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Асоциираните с гостоприемника микроби могат да бъдат от решаващо значение за оцеляването на гостоприемника [1], както е илюстрирано от голям обем работа върху асоциации на насекоми-гостоприемници. По-специално, свързаните с червата микробни симбионти могат да осигурят на своите гостоприемници насекоми ограничаващи хранителни вещества [2] или да подобрят храносмилането на сложни съединения [3]. Например, бактериите в средното черво на комара Aedes aegypti помагат да лизират червените кръвни клетки, позволявайки ефективно усвояване на хранителните вещества от гостоприемника [4]. Микробите могат също да помогнат за детоксикация на диетата на гостоприемника, както се наблюдава при боб-бъгове и смрадлици, чиито симбионти разграждат инсектицидите [3, 5]. По този начин чревните бактерии могат директно да повлияят на годността на приемника: прилагането на антибиотици намалява плодовитостта на A. aegypti [4] и забавя растежа на ларвите при Anopheles stephensi [6]; и без микроби дрозофила показват намалена продължителност на живота и растежа на ларвите [7].

предците

Такива силни микробни асоциации гостоприемници и черва е по-вероятно да се развият в стабилна среда [8], особено ако микробите се предават през поколенията гостоприемници. Не е ясно обаче дали и до каква степен могат да се поддържат такива взаимодействия между микроби и насекоми, когато домакините претърпят значителни промени в околната среда през целия си живот или през следващите поколения. Например, универсалните насекоми могат да се хранят с множество ресурси за няколко поколения, като потенциално вземат проби от голямо разнообразие от свързани с диетата микробни общности. По-общо казано, когато всяко насекомо претърпи диетична промяна, както гостоприемникът, така и неговият микробиом могат да се сблъскат с нов натиск за подбор. Ако гостоприемникът се възползва от чревния си микробиом в местообитанието на предците, промяната в диетата може да наруши полезната микробна общност и да намали годността на гостоприемника. В този сценарий какви са възможните адаптивни траектории на разположение на хоста и какъв е ефектът върху неговия микробиом?

Най-общо казано, има четири възможни въздействия от промяната в диетата на гостоприемника върху микробиома (Фигура 1). За всеки отделен случай има две допълнителни възможности: гостоприемникът и неговата микробна общност могат да бъдат функционално свързани или гостоприемникът може само пасивно да придобие и приюти микробната общност. Вероятността за всяка от тези траектории зависи от множество фактори, като например разликата между хранителното съдържание и последиците от фитнеса на предците и новите диети; разликата между свързаните с диетата микроби във всяка среда; и относителните нива на адаптивни мутации в гостоприемника и микробите. Към днешна дата обаче няма проучвания, които директно да са тествали въздействието на промените в околната среда върху дългосрочната съдба на асоциациите гостоприемник-микробиом. Като специфичен пример за бърза промяна в околната среда, диетичните промени предлагат възможност за преодоляване на тази разлика. Тъй като диетичните промени са повсеместни при насекомите, изследването на взаимодействията между гостоприемника и микробиома в контекста на диетичните промени също може да предложи нови прозрения в екологията и еволюцията на насекомите.

Имайте предвид, че въпреки че микробите със сигурност ще придобият мутации по време на лайна на диетата на гостоприемника, тук ние се позоваваме само на мутации, които влияят върху годността на гостоприемника.

МЕТОДИ

Популации на бръмбари

За всички експерименти използвахме безплодна популация от бръмбар Tribolium castaneum, генерирана с помощта на възрастни от 12 популации, събрани в дива природа от цяла Индия. Поддържахме популациите от запаси в 4-седмични цикли на дискретно генериране в пшенично брашно, доставено от една компания. Поддържахме торбички с брашно при -80 ° C в продължение на 4 часа, за да убием всички яйца от насекоми в брашното. След това оставихме торбите да се размразят при стайна температура. Използвахме това брашно за всички наши експерименти. Всяко поколение разрешихме на възрастните да яйцеклетки в продължение на 1 седмица и след това ги отстранихме от брашното. След 4 седмици на развитие използвахме полученото възрастно потомство, за да стартираме следващото поколение. Настанихме популации в кръгли пластмасови кутии с 2500 до 3000 възрастни на поколение.

За експериментално еволюиращи популации, адаптирани към нови ресурси (13 популации в царевица и 12 в сорго), ние създадохме реплицирани популации със 100, 200 или 500 възрастни с плътност от 1 g брашно на индивид (популациите бяха част от независимо проучване, което изисква променлива основни размери на популацията). Тези популации също се поддържат в отделни цикли на генериране. Тъй като развитието на личинките в царевицата е бавно, ние оставихме популации царевица за развитие за 6 седмици, което доведе до по-малко поколения експериментална еволюция в царевицата. Всяко поколение преброихме броя на живото потомство на възрастни и изчислихме скоростта на растеж на населението като: (# Възрастни t - # Възрастни t − 1)/(# Възрастни t − 1).

Нарушаване на свързаните с брашно микробни съобщества

Нарушихме микробната общност на брашното чрез облъчване на тънки слоеве брашно под ултравиолетова светлина в продължение на 2 часа в ламинарна качулка без въздушен поток. Алтернативно смесихме брашно с един от трите различни антибиотици с широк спектър (тетрациклин, ампицилин или канамицин, 0,005% тегл./Тегл.). Добавихме единични яйца или възрастни към третирано брашно в ламинарен абсорбатор (в микроплаки с 96 ямки, петридиши, микроцентрифужни епруветки или кутии) и съхранявахме всички контейнери в по-големи херметически затворени кутии по време на експеримента, за да предотвратим последващо замърсяване. Обработвахме и съхранявахме контролни групи (с необработено брашно) при идентични условия, пропускайки само стъпката на облъчване.

Фитнес анализи

За успешното колонизиране на нова среда, женската плодовитост и оцеляването на потомството са от решаващо значение. Следователно, за да се оцени годността, ние измерихме плодовитостта и оцеляването на яйцата в обеднели микроби спрямо необработено брашно. За измерване на плодовитостта изолирахме 2-седмични възрастни жени в 0,7 g пресято брашно за 48 h и преброихме броя на яйцата, снесени от всяка женска (n = 25 женски на лечение). За да измерим оцеляването на яйцата, ние събрахме

100 индивида от популацията и им позволи да яйцеклетки за 24 часа в 100 g пресято пшенично брашно (пресяването със сито № 50 премахва големи частици брашно, което улеснява идентифицирането и преброяването на яйцата). Изолирахме яйца в 96 ямкови плаки и ги снабдихме с брашно, както се изисква за всяко експериментално третиране (например необработено спрямо обработено с UV брашно). Преброихме броя на оцелелите потомци след 3 седмици (n = 96 яйца/третиране/блок; два независими блока на лечение).

За експериментално еволюирали популации, ние събрахме 50 жени след планирания 1-седмичен период на яйцекладка от 17-то поколение (за популации, адаптирани към сорго) или 10-то поколение (за популация, адаптирана към царевицата). Спомнете си, че иначе тези жени биха били изхвърлени; следователно, ние не смущаваме еволюиращите популации по време на тези анализи. На този етап женските са били на възраст 2-3 седмици, много в рамките на пиковия си период на плодовитост. За да измерим плодовитостта, изолирахме женските и им позволихме да се ядат

0,7 g пресято брашно (необработена или обработена с ултравиолетови лъчи царевица или сорго; n = 25 жени/обработка) за 48 часа. За да измерим оцеляването на яйцата, ние събрахме

100 индивида на 18-то поколение (адаптирано сорго) или 11-то поколение (адаптирано царевица) и им позволи да яйцеснасят в 50 g пресято брашно за 24 часа. Измерихме оцеляването на яйцата в подходящия ресурс, както е описано по-горе. Развитите линии, които не се адаптират успешно към новите ресурси, имат много нисък размер на популацията и следователно нямаме достатъчен размер на извадката за провеждане на анализи за фитнес.

Въвеждане на микроби в брашно, обработено с ултравиолетови лъчи

За да анализираме въздействието на фитнеса на микробите, свързани с предци или еволюирали популации, въведохме тези микроби в третирано с UV пресято брашно чрез фекални вещества на ларвите. За да тестваме въздействието на предшествените микроби, разрешихме

на възраст от две седмици) от популация от пшеничен запас за консумиране и дефекация в брашно, обработено с ултравиолетови лъчи за 24 часа. За да контролираме независимите от микробите ефекти от въвеждането на ларвите, отново обработихме половината от това брашно с ултравиолетови лъчи, за да изчерпим микробния товар. След това измерихме плодовитостта или при обогатени с микроби, или при изчерпани лечения, както е описано по-горе (n = 25 жени/лечение). За да тестваме въздействието на микробите от адаптирани популации, ние събрахме възрастни от адаптираната популация на сорго на поколение 8 и им позволихме да яйцеклетки в прясно брашно от сорго. Събрахме ларви след 2 седмици и ги използвахме за въвеждане на свързани със сорго микроби в обработена с ултравиолетови лъчи пшеница или сорго. По същия начин, ние събрахме възрастни от популацията, адаптирана към царевицата на поколение 12, позволихме им да яйцеклетки в прясно царевично брашно и използвахме 2-седмични ларви за въвеждане на микроби, адаптирани към царевица, в царевица, третирана с ултравиолетови лъчи.

Определяне на състава на бактериалната общност

Определихме бактериалната общност, свързана с проби от брашно и бръмбари, използвайки ампликон секвениране на гена 16S rRNA. За всяко лечение изолирахме 2-7 индивида (ларви или възрастни женски на 1 седмица) и ги стерилизирахме на повърхността, използвайки 70% етанол, последвано от измиване с ДНКаза и без РНКаза ултра чиста вода. За да идентифицираме свързаните с брашното микроби, събрахме четири повторни проби от брашно (

Средно открихме

300 бактериални OTU в проби от брашно и

450 бактериални OTU в проби от бръмбари (Фигури S1-S3). Първо визуализирахме цялата бактериална общност, присъстваща във всяка проба, използвайки неограничен клъстеризиращ подход (Principle Coordinate анализ, PcoA) с функцията pcoa в пакета R ape v5.1 [16] и генерирахме графики, използвайки функцията biplots в R пакет BiplotGUI [17]. Също така използвахме ограничено клъстериране (анализ на ординацията) с функцията CAPdiscrim в пакета BiodiversityR [18]. За да тестваме статистически въздействието на обработките с брашно и ресурси върху пълни бактериални съобщества, използвахме PERMANOVA анализи, внедрени с функцията Adonis в пакета Vegan [19].

Пълната бактериална общност е сложна и следователно е трудно да се визуализира. Следователно, за да визуализираме вариациите в най-доминиращите бактериални OTU, ние също анализирахме петте най-разпространени OTU в репликирани проби от дадено лечение (вижте Фигура S4 за пример). Тези доминиращи бактерии са по-склонни да играят функционална роля в асоциацията гостоприемник-микроб, тъй като очакваме полезните бактерии да се обогатят в асоциираната с бръмбари общност. Обърнете внимание, че различни проби в рамките на набор за сравнение може да не споделят нито един от най-разпространените OTU. Следователно, в окончателния списък на най-многобройните OTU при конкретно сравнение, бихме могли да имаме някъде между 5 OTU (ако всички обширни OTU са споделени) и 25 OTU (ако петте най-богати OTU са уникални за всяка група). Ние обединихме всички бактериални OTU, които не бяха сред 5-те най-разпространени във всяка проба, в категорията „други“.

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Дарвин известен стартира своя знаков документ за линейското общество [20] с фразата „Цялата природа е във война“, отнасяща се до продължаващата борба на организмите за съществуване. Много еукариоти обаче не са сами в тази борба, но разчитат на микроби, които осигуряват решаващи ползи за фитнеса. Въпреки това, по-голямата част от нашето разбиране за такива взаимоотношения гостоприемник и микроби произтича от проучвания в единична среда. Какво се случва, когато организмите се разпръснат в нови местообитания, техният микробиом е нарушен и техните микробни партньори или липсват, или не могат да се установят в новата среда?

Пригодността на бръмбарите зависи от брашнените микроби в родовия произход, но не е нов ресурс

Първо проверихме дали брашнените бръмбари извличат полза от тяхната микробна флора и дали микробите са придобити в околната среда или се предават вертикално. Нарушихме микробната общност, свързана с околната среда на брашнените бръмбари, като обработихме брашното с ултравиолетово лъчение и въведохме индивидите в обработеното брашно. В рамките на 48 часа наблюдавахме значително намаляване на плодовитостта на жените в пшенично брашно, обработено с ултравиолетови лъчи (фиг. 2А; t-тест за обработено с ултравиолетови лъчи спрямо необработено пшенично брашно, p = 0,0002. оцеляването на яйцата също намалява при третираната с ултравиолетови лъчи пшеница (фиг. 2В; тест ChiSq за данни за броя, р = 0,003), както и други фиксирани прокси като продължителност на живота на възрастни и телесна маса (фиг. S5; тест на Каплан-Майер за продължителност на живота: р 0,05; 2A-B) и добавянето на ампицилин към брашното от сорго не променя плодовитостта в соргото (t-тест за ефекта на ампицилин в сорго, p = 0,99; фиг. S6C). както на ларвен, така и на възрастен етап на живот, но само в ресурса на родовата пшеница, към който гостоприемниците са добре адаптирани.

Защо въздействието на фитнеса на микробите от брашно зависи от ресурсите? Една от възможностите е, че новите ресурси са толкова неоптимални, че не бихме могли да открием малко въздействие на брашнените микроби в тези анализи. Това обаче е малко вероятно, тъй като годността на бръмбарите в просото и соргото не се различава драстично от тази при необработената пшеница (фиг. 2А-В). По този начин нашите резултати вероятно не отразяват силата на подбора, наложена от новата среда. Друга възможност е, че не нарушихме достатъчно микробната общност в новите ресурси и следователно не наблюдавахме фитнес ефект. Последователността на 16S рРНК ампликони обаче показва, че различните брашна съдържат различни бактериални съобщества и че UV лечението значително нарушава общностите във всеки отделен случай (Фиг. S7; PERMANOVA: presource Въвеждането на микроби от предци в нови ресурси увеличава плодовитостта. Boxplots показват средния брой на снесените яйца в брашно, обогатено с пшенични микроби, или в обогатено брашно след допълнителна ултравиолетова обработка (виж схемата отгоре; + Wh = пшенични микроби; n = 25 женски на обработка; парцели и сурови данни са показани, както е описано на фигура 2). Звездичките показват значителна разлика между необработен и обработен с ултравиолетови лъчи ресурс.

Бокс-парцелите показват средния брой на яйцата, положени в брашно, обогатено с пшенични микроби, или в обогатено брашно след по-нататъшна UV обработка (виж схемата отгоре; + Wh = пшенични микроби; n = 25 жени на обработка; боксови площи и сурови данни са показани, както е описано на фиг. 2). Звездичките показват значителна разлика между необработения и третиран с ултравиолетови лъчи ресурс.

Постепенното възстановяване на предшествения микробиом подпомага адаптирането към нови ресурси

(А)Схематично представяне на експерименталния еволюционен режим. (B и C) Брой възрастни на популация през поколения, за адаптирани популации (черни) и една популация, които не са се адаптирали успешно (червени), за (Б) царевица и (° С) сорго. (Д) Плодовитост (n = 25 женски на третиране) в необработено срещу обработено с UV брашно за женски прародители („Anc“: захранва се с новия ресурс за едно поколение) или за жени от популации, които са се адаптирали към новия ресурс („ Ада ”). Плотове и сурови данни са показани, както е описано на фигура 2. Звездичките показват значителна разлика между необработения и обработения с ултравиолетови лъчи ресурс. (E) Фракция на оцелелите потомци след 3-седмично развитие в необработено или обработено с ултравиолетови лъчи брашно (n = 96 събрани яйца за обработка), за яйца, получени от предци или адаптирани популации, както по-горе. Звездичките показват значителна разлика между необработения и обработения с ултравиолетови лъчи ресурс.

Нова, но проста адаптивна пътека в нови местообитания

Въз основа на нашите резултати (обобщени на Фигура 6), ние постулираме следната траектория на промени в асоциацията гостоприемник-микробиом по време на адаптация. Веднага след въвеждането в новите местообитания микробиомът на бръмбарите-основатели се измести драстично, за да отрази бактериалната общност, свързана с новата диета. Въпреки че възрастните основатели също носят (и въвеждат) бактерии, получени от пшеница чрез фекалните си вещества, тези бактерии са или редки, или не са в състояние ефективно да колонизират червата на бръмбарите в присъствието на новите микроби, свързани с брашното и новата диета. Така първоначално много малко бръмбари са хранили полезни бактерии. През поколенията - тъй като индивидите, които приютяват бактериите, също се размножават повече - изобилието от полезни бактерии от предците се увеличава в новото местообитание. На този етап можем да наблюдаваме зависимост на годността на бръмбарите от брашнените микроби.

Знаците „+“ показват относителна годност на бръмбарите във всеки ресурс, със или без достъп до свързани с брашно микроби (както е посочено от бактериите вътре в бръмбарите). Случаите, в които наблюдаваме значителен спад на фитнеса, зависим от микробите, са подчертани в бледо зелено (въз основа на двойно сравнение между бръмбари с нормални и изчерпани микробни натоварвания). Празните клетки показват липсващи данни.

Тъй като бръмбарите се събират в подобни общности в различни ресурси, ние също предполагаме, че бактериите, свързани с такива бръмбари-генералисти, самите те могат да бъдат генералисти, подобрявайки годността на гостоприемника в множество ресурси. Всъщност, бактериите от рода Enterococcus и семейство Enterobacteriacae (доминиращи таксони, свързани с бръмбари, адаптирани към пшеница) често се срещат в червата на няколко насекоми [8]. Като цяло, ентерококите могат да използват различни захари и въглехидрати; например човешкият червен коменсал Enterococcus faecalis може да смила широк спектър от растителни въглехидрати като целулоза, които хората не могат да усвоят [21, 22]. По същия начин членовете на семейство Enterobacteriacae обикновено се намират в складове за складирани зърна и могат да растат на различни зърнени култури [23]. По този начин тези бактерии могат да имат метаболитен потенциал да използват множество ресурси. В по-нататъшна работа се надяваме да проверим дали тези таксони са особено подходящи за колонизиране на червата на бръмбарите и/или използват различни зърнени култури и са конкретно отговорни за наблюдаваната асоциация между бръмбари и микробиоми.

Заключения

Наблюдавахме изненадващо бързо и повторяемо възстановяване на предшествените микробиоми в различни ресурси и популации, което предполага очарователна парадигма за еволюция на гостоприемника в нови местообитания. Предполагаме, че това може да е общо явление, при което въвеждането на микроби от предци може да намали вероятността от изчезване на гостоприемника в нова среда. И обратно, медиираното от домакините разпръскване може също да позволи на бактериите да колонизират различни местообитания, като същевременно променя микробните съобщества в нови среди. Следователно, както бактериалните партньори, така и гостоприемникът могат да повлияят способността на другия да вземат проби и да колонизират нова среда. По този начин нашата система за изследване предоставя уникална възможност за анализ на гостоприемници, както и на свързаните с тях бактерии по време на установяването на асоциации гостоприемник-микроб.

ВНОСКИ НА АВТОРА

Замислени и проектирани експерименти: DA, AA. Проведени експерименти: AA. Анализирани данни: AA, DA. Написа ръкописа: DA, AA. Придобито финансиране: DA.

ПРИЗНАВАНИЯ

Благодарим на членовете на лабораторията Агаше за коментари по ръкописа; Amruta Rajarajan, Soumya Panyam, Gaurav Agavekar и Riddhi Deshmukh за лабораторна помощ; Gaurav Diwan, Kruttika Phalnikar, Umesh Mohan и Rittik Deb за помощ при QIIME и R анализ; и Awadhesh Pandit и други служители от съоръжението за последователно следващо поколение в NCBS. Признаваме финансирането и подкрепата от стипендията на Wellcome Trust DBT India Alliance (номер на безвъзмездна помощ IA/I/17/1/503091 за DA) и Националния център за биологични науки (NCBS).