Резюме

Заден план

Насекомите приютяват безброй микроорганизми, много от които могат да повлияят на съотношението на половете и да манипулират размножаването на гостоприемника. Leptocybe invasa е инвазивен вредител, който причинява сериозни щети на евкалиптовите насаждения и телитозният партеногенезис, устойчивост на ниска температура, защита в гали, припокриване на генериране и малко тяло на L. invasa допринасят за нейната бърза инвазия и прираст на населението. Въпреки това, ендосимбиотичният бактериален състав, изобилието и половите разлики на L. invasa остават неясни. Следователно, това изследване има за цел да идентифицира бактериалните съобщества в L. invasa възрастни и ги сравнете между половете на L. invasa род Б.

Резултати

Платформата Illumina MiSeq е използвана за сравняване на състава на бактериалната общност между жени и мъже от L. invasa чрез секвениране на V3-V4 региона на 16S рибозомния РНК ген. Получени са общо 1320 оперативни таксономични единици (OTU). Тези OTU бяха подразделени на 24 фила, 71 класа, 130 ордена, 245 семейства и 501 рода. На ниво род доминиращите бактерии при жените и мъжете бяха Рикетсия и Ризобий, съответно.

Заключение

Ендосимбиотичните бактерии на L. invasa жените и мъжете бяха много разнообразни. Имаше разлики в бактериалната общност на L. invasa между половете и бактериалното разнообразие при мъжките екземпляри е по-голямо от това при женските екземпляри. Това проучване представя цялостно сравнение на бактериалните съобщества в L. invasa и тези данни ще предоставят цялостна представа за бактериалната общност и при двата пола на L. invasa със специално внимание върху свързаните с пола бактерии.

Въведение

Към днешна дата малко проучвания са докладвали за цялостните ендосимбиотични бактерии на L. invasa, което е инвазивно насекомо, индуциращо жлъчката. Само няколко проучвания са изследвали цялостно ендосимбиотичните бактерии в този вид. Wang et al. (2018) култивирани 11 щама от възрастни жени на L. invasa през зимата, използвайки традиционни методи и ги класифицира в три вида (Firmicutes, Actinobacteria, и Протеобактерии), три класа (Бацили, актинобактерии, и Гамапротеобактерии) и четири поръчки (Бацили, микрококали, лактобацили, и Enterobacterales), които бяха свързани с растежа, развитието, метаболизма на храненето и имунитета. Nugnes et al. (2015) изследва бактериите, живеещи при възрастни сред различни популации чрез анализ на денатурираща градиентна гел електрофореза (DGGE) и установява, че Рикетсия настъпили в репродуктивните тъкани на жената L. invasa, предполагащ връзка с неговата телитозна партеногенеза. L. invasa крие безброй бактерии и бактериалните различия между половете имат силно въздействие върху насекомите, като ефекти върху репродуктивната регулация (Wang et al., 2018; Nugnes et al., 2015). Следователно, общият ендосимбиотичен бактериален състав и изобилие от L. invasa и разликите между половете са важни за изучаване.

В това проучване ендосимбиотичните бактерии при възрастни жени и мъже на L. invasa са идентифицирани чрез 16S rRNA секвениране на V3-V4 региона, за да хвърли светлина върху техните вътрешни бактериални състави. Жените и мъжете също са сравнени за справяне със сексуалните различия в ендосимбионтите. Тези резултати ще осигурят ценен бактериален фонд за L. invasa и допълнително ще допринесе за разбирането на неговите репродуктивни стратегии и механизми за инвазия.

Материали и методи

Вземане на проби от насекоми

Клонове на DH 201-2 (Eucalyptus grandis × E. tereticornis) (Myrtales: Myrtaceae), приютяваща гал L. invasa бяха отстранени от учебната и експериментална база на Горския колеж, Университет Гуангси (108 ° 17′E, 22 ° 51′N), град Нанин, автономна област Гуангси Жуан от юли до август 2018 г. Клоновете бяха поставени в пластмасова бутилка, пълна с вода, за да запази свежестта, и се прехвърля в запечатана мрежа с клетка (40 cm × 40 cm × 80 cm) при стайна температура, за да не се спасяват възрастните. Водата в пластмасовата бутилка се подновява ежедневно до появата на L. invasa възрастни. Половете са идентифицирани чрез морфологично наблюдение (Zheng et al., 2014b).

ДНК екстракция

Петдесет възрастни от всеки пол на L. invasa нововъзникналите в рамките на 12 часа бяха гладувани за 6 часа. След това и двете проби бяха стерилизирани външно със 75% етанол за 2–5 минути и изплакнати 3 пъти със стерилизирана вода, за да се отстранят микробите на повърхността. Общата бактериална ДНК на всяка проба беше извлечена с помощта на Power Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories) в съответствие с инструкциите на производителя. Качеството и количеството на ДНК се оценяват чрез съотношенията 260 nm/280 nm и 260 nm/230 nm. След това квалифицираната ДНК се съхранява при -80 ° C за по-нататъшна обработка. ДНК на всеки индивид се извлича чрез използване на метод на база Chelex-100 и протеиназа К (Gebiola et al., 2009).

PCR амплификация и клониране на бактериалния 16S rRNA ген

Биоинформатика и статистически анализ

След секвениране, PE четенията, получени с HiSeq секвениране, бяха обединени чрез припокриване, за да се получат сурови маркери. За да се получат чисти маркери, суровите етикети бяха деноизирани, сортирани и разделени с помощта на Trimmomatic (версия 0.33). Останалите последователности бяха филтрирани за излишък и всички уникални последователности във всяка проба бяха групирани в оперативни таксономични единици (OTU) въз основа на 97% сходство. OTU с ниско изобилие бяха идентифицирани и елиминирани с помощта на UCHIME v4.2. Таксономичното разпределение на OTU беше проведено с референтната база данни Silva. Таблиците за изобилие на видове са генерирани от QIIME и структурите на общността във всяка категория таксони са начертани от софтуера R. Относителното изобилие на бактериите се определя чрез проценти.

Алфа-разнообразието въз основа на оценките за богатство Chao1 и ACE, както и индексите за разнообразие на Симпсън и Шанън, беше оценено с помощта на програмата mothur v.1.11.0. Сред тези мерки Chao1 и ACE отразяват богатството на видовете в пробите, индексът на Шанън отразява разнообразието на общността, индексът на Симпсън отразява доминирането на видовете в общността, а индексът на покритие отразява степента, до която резултатите от секвенирането представляват действителния състав на микроорганизмите в пробите.

Молекулярна характеристика и филогенетични анализи

COI се усилва чрез използване на праймер LCO1490 и обратен праймер HCO2198 (Nugnes et al., 2015). 16S рРНК гена на Рикетсия се усилва чрез използване на праймерите, изброени в таблица S1. Програмата за PCR и за двата гена (COI и 16S рРНК) беше следната: 3 минути първоначална денатурация при 94 ° C, 30 цикъла при 94 ° C за 30 s, 55 ° C за 30 s и 72 ° C за 1 min и окончателно удължаване от 5 минути при 72 ° С. PCR продуктите бяха наблюдавани чрез използване на 1.0% агарозна гел електрофореза и амплифицираните фрагменти бяха директно секвенирани от TsingKe Biological Technology Co., Ltd, Пекин, Китай. Представителни последователности на други региони бяха изтеглени от GenBank и подравняването на последователностите беше завършено с помощта на Clustal X. Методът за присъединяване на съседи беше използван за изграждане на консенсусно филогенетично дърво със софтуера MEGA7. За да се оцени поддръжката на клона на филогенетичното дърво, беше извършен анализ на bootstrap на 1000 повторения.

Номера за присъединяване

Данните са налични в NCBI SRA, номера за присъединяване: SRR9591039, SRR9591038. Последователностите COI и 16S rRNA, определени в това проучване, са депозирани в базата данни GenBank с номера за присъединяване MN524231 и MN524230, съответно.

Резултати

Секс на L. invasa проби в това проучване

Всички женски и мъжки екземпляри са идентифицирани въз основа на морфологията. В това проучване са събрани общо 656 жени и 51 мъже (Таблица S2). Материалите са депозирани в Лабораторията за опазване на горите, Горски колеж, Университет Гуангси, Нанинг 530004, Китай.

Последователност и класификация

Общо 533 266 сурови етикети (370 680 от мъже и 162 586 от жени) са получени за L. invasa, и са генерирани 476 235 чисти маркера (328 833 от мъже и 147 402 от жени) (таблица S3), които са класифицирани в различни OTU въз основа на 97% сходство. Сред 476 235 чисти маркера са получени общо 1320 OTU; от тези 1320 OTU, 154 са общи за двата пола, а 38 и 1128 са специфични съответно за възрастни жени и мъже (Фиг. 1).

бактериалното

Фигура 1: Диаграма на Venn за разпределение на OTU в Leptocybe invasa възрастни жени и мъже.

Анализ на алфа разнообразието

Алфа разнообразието се оценява от пет индекса: Chao1, индекса на Шанън, индекса на Симпсън, ACE и покритието. Резултатите в таблица 1 показват, че бактериите в L. invasa възрастните са разнообразни и при двата пола. Стойностите Chao1 (229.50 срещу 1282.00) и ACE (212.84 срещу 1282.28) са по-ниски при жените, отколкото при мъжете. Добро съгласие се наблюдава и между индексите Симпсън и Шанън. Индексът на Шанън (0,59 срещу 6,13) е по-нисък при жените, отколкото при мъжете, докато индексът на Симпсън (0,85 срещу 0,01) е по-висок при женските оси, отколкото при мъжките оси, което показва, че разнообразието на бактериалната общност при мъжете е по-висока от тази при жените. Покритието е било близо 100% както за мъже, така и за жени, илюстриращо по-голяма вероятност от откриване на бактерии, отколкото при неоткриване на бактерии.

Примерно покритие на ACE Chao1 Simpson Shannon
Женски пол 212,84 229.50 0,85 0,59 1.00
Мъжки пол 1282,28 1282,00 0,01 6.13 1.00

Анализ на състава на общността и изобилието от видове

Съставът на бактериалната общност и изобилието на видовете и при двата пола на L. invasa бяха анализирани (изобилие над 0,1%) въз основа на резултатите от OTU (Таблица 2, Фиг. 2). Общо 24 фили бяха открити и класифицирани в пробите. Протеобактерии е доминиращият бактериален тип, коментиран при жени и мъже, съответно 95,63% и 34,99% от бактериите. На ниво род, Рикетсия (с изобилие от 93,67%) и Ризобий (с изобилие от 5,73%) са доминиращите бактерии съответно при жените и мъжете. Освен това беше забележително, че изобилието от Рикетсия е по-малко от 1% при мъжете (Таблица 3).

Примерен семеен род за клас от тип
Женски пол 10 26 44 76 122
Мъжки пол 24 69 127 238 487
Специфично за жените 0 2 3 7 14.
Специфично за мъжете 14. 45 86 169 379
Общ секс 10 24 41 69 108
Обща сума 24 71 130 245 501

Фигура 2: Относително изобилие от топ 10 бактерии на нива на тип (A), клас (B), ред (C), семейство (D) и род (E) при жени и мъже от Leptocybe invasa.

Род Жена (%) Мъж (%)
Рикетсия 93,67 0,04
Uncultured_bacterium_f_Bacteroidales _S24-7_група 0,71 5.37
Лактобацилус 0,31 2.38
Сфингомонада 0,25 2.62
Бактероиди 0,11 1,65
Fusobacterium 0,04 3.49
[Eubacterium] _копростанолигени _група 0 2.34
Ризобий 0 5.73
Неизвестно 0 0,01
Ксантомонада 0 1.83
Други 4.48 66,68
Некласифициран 0,44 7,86

Молекулярна характеристика и филогенетични анализи

След сравнение с Genebank, идентифицирането на L.invasa в това изследване е родословна линия B, а филогенетичното дърво на COI също показва, че популацията от това изследване принадлежи към родословната линия (фиг. 3). Филогенетичният анализ на 16S рРНК гени разкри, че Рикетсия на L. invasa симбионтите принадлежаха на Рикетсия преходна група (фиг. 4).

Фигура 3: Филогенетично дърво от различни Leptocybe invasa популации на базата на COI последователности.

Фигура 4: Филогенетичен анализ на различни Рикетсия групи въз основа на техните 16S рРНК последователности.

Дискусия

Различия в бактериите между възрастни жени и мъже

Това изследване разкри, че бактериите са се скрили в L. invasa са имали голямо разнообразие и много от ендосимбиотичните бактерии са били анотирани в този вид за първи път. Въз основа на анализ на алфа разнообразието, разнообразието на ендосимбиотичните бактерии при мъжете е по-високо от това при жените (Таблица 1). Разликата в бактериалните съобщества между мъже и жени може да бъде обяснена отчасти с различия във физиологичната структура и между двата пола на L. invasa; по-специално, женските оси имат яйчници, които съдържат изобилие от Рикетсия, позволявайки на рода да заема различни бактериални ниши, отколкото при мъжете (Nugnes et al., 2015). Друга възможност е насекомите да инициират вродени и систематични имунни реакции, за да се справят с колонизацията на микроби (Leulier & Royet, 2009) и женските имат по-силна имунна система от мъжете (Kurtz et al., 2000).

Сравнение на бактериите с тези на други насекоми

Анализът на бактериалната общност на ниво фигура показа това Протеобактерии беше доминиращата група при женските и мъжките оси и Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria и Фузобактерии също бяха коментирани. Предишни проучвания разкриха това Протеобактерии са били доминиращи при други Hymenoptera, като напр Apis cerana и мравки за рязане на листа (Ahn et al., 2012; Zhukova et al., 2017). За разлика, Фиксира и Бактероидети са основните бактериални видове, открити в червата на термитите (Miyata et al., 2007; Xiang et al., 2012) и пчелите (Mohr & Tebbe, 2006). Фиксира и Актинобактерии са били доминиращите бактерии в A. mellifera и пчели (Ahn et al., 2012; Praet et al., 2018).

Путативни функции на доминиращи ендосимбиотични бактерии в L. invasa

Търсенето на сходство на последователност разкри това Ризобий е била доминиращата бактерия при възрастни мъже (фиг. 2, таблица 3). Ризобий произвежда разнообразни ензими с хидролизиращи целулоза и пектин дейности, които могат да хидролизират гликозидния скелет на растителната клетъчна стена и да играят много важна роля в симбиозата между Ризобий и бобови растения (Robledo et al., 2008; Huang et al., 2018). Ризобий е ендосимбионт, открит в червата на някои фитофаги и може да помогне на гостоприемника да синтезира азотсъдържащи вещества, които липсват в храната (Russell et al., 2009).

Заключения

Резултатите от това проучване, получени чрез висока производителност, разкриват бактериалното разнообразие и разликите между половете в L. invasa, предполага, че има богата ендосимбиотична бактериална общност и някои бактерии са докладвани в L. invasa за първи път. Освен това мъжките са имали по-разнообразна бактериална общност от женските. Следващото изследване трябва да се съсредоточи върху бактериите, открити в това проучване, за да идентифицира специфичните им екологични функции и специфичния механизъм за регулиране, основан на пола Рикетсия поява в L. invasa.