Роли Куриране на данни, методология, писане - оригинален проект

диабет

Катедра по биохимия, Природен факултет, Александрийски университет, Александрия, Египет

Концептуализация на роли, официален анализ, разследване, надзор, валидиране, писане - преглед и редактиране

Катедра по биохимия, Природен факултет, Александрийски университет, Александрия, Египет

  • Шаймаа А. Абдулмалек,
  • Махмуд Балбаа
  • Член
  • Автори
  • Метрика
  • Коментари
  • Медийно покритие
  • Партньорска проверка

Фигури

Резюме

Предистория и цели

В настоящата статия ние изследваме нова стратегия на селеновите наночастици (Se-NPs) за лечение на захарен диабет тип 2 (T2DM) чрез изследване на ефекта на Se-NPs самостоятелно и в комбинация със стандартното антидиабетно лекарство метформин (MET ) при диета с високо съдържание на мазнини/индуциран от стрептозотоцин (HFD/STZ) T2DM.

Методи

HFD се добавя всеки ден към експериментални плъхове в продължение на 8 седмици, последвано от еднократна инжекция с ниска доза от 35 mg/kg STZ за индуциране на T2DM. Синергичният ефект на различните терапевтични стратегии върху диабетичните усложнения беше оценен след Se-NPs и MET приложение в продължение на 8 седмици. Проведени са молекулярни и биохимични анализи, за да се разбере ефективността на нашето лечение върху инсулинова чувствителност, окислителни медиатори и възпалителни маркери.

Резултати

Нашите наблюдения демонстрираха, че индуцираните от HFD/STZ плъхове имат токсичен ефект върху серума и чернодробните тъкани, което води до предизвикване на значителни окислителни увреждания и хипер-възпаление със значително нарушение в инсулиновия сигнален път. Експериментални животни, лекувани с монотерапевтични две дози Se-NP (0,1 и 0,4 mg/kg) и/или MET (100 mg/kg) самостоятелно, както и комбинираната терапия доведоха до забележителен защитен антидиабетен ефект, илюстриран от значително намаление на нивата на кръвната захар и инсулин на гладно след 8 седмично лечение. В същото време нивата на активни инсулинови сигнализиращи протеини pIRS1/pAKT/pGSK-3β/pAMPK бяха значително подобрени. Нещо повече, Se-NPs проявяват противовъзпалителен ефект чрез смекчаване на експресията на цитокини и балансът между оксидативен стрес и антиоксидантен статус е възстановен. Освен това, прилагането на антидиабетно лекарство MET също показа значително подобрение на диабетните усложнения след периода на лечение.

Заключение

Това проучване предоставя мощно механизма на действие на комбинираните Se-NPs и MET като обещаваща терапевтична алтернатива, която синергично облекчава повечето от диабетните усложнения и инсулиновата резистентност.

Цитат: Abdulmalek SA, Balbaa M (2019) Синергичен ефект на нано-селен и метформин върху модел на диабетични плъхове тип 2: Успокояване на диабетичните усложнения чрез инсулинова чувствителност, окислителни медиатори и възпалителни маркери. PLoS ONE 14 (8): e0220779. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220779

Редактор: Michael Bader, Max Delbruck Centrum fur Molekulare Medizin Berlin Buch, ГЕРМАНИЯ

Получено: 25 май 2019 г .; Прието: 23 юли 2019 г .; Публикувано: 23 август 2019 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Авторите не са получили конкретно финансиране за тази работа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

През последните няколко години вниманието привличат световните епидемични хронични заболявания като T2DM. Разпространението на диабета е било 425 милиона през 2017 г. според Международната диабетна федерация (IDF), този брой се очаква да нарасне до 2045 г. до 629 милиона с 48% увеличение. В допълнение, честотата на диабета в Близкия изток и Северна Африка е била 39 милиона през 2017 г. и ще нарасне до 82 милиона до 2045 г. със 110% увеличение. Сред всички видове диабет, T2DM представлява по-голямата част от случаите на диабет, представляващи около 90% (IDF Diabetes Atlas. 2017). Много изследвания имат за цел да изяснят метаболитните и молекулярните промени в инсулиновите сигнални пътища, възникващи при T2DM и участващи в развитието на IR, един от основните белези на патогенезата на T2DM [1]. Ясно е, че инсулиновият сигнален път започва чрез свързване на инсулина с неговите рецептори върху целевите клетки. Тогава активационните събития започват в клетките чрез активиране на инсулиновия рецептор-β и IRS1, като по този начин се набира PI3K до неговото местоположение. Основната цел на PI3K в чернодробните клетки е AKT, който играе ключова роля в усвояването на глюкозата [2]. Предишни проучвания демонстрират, че регулирането на pIRS1 и pAKT играе основна роля за подобряване на усвояването на глюкозата и регулиране на нейните нива в кръвта [3].

Пациентите с диабет споделят няколко патологични характеристики, включващи възпаление и оксидативен стрес. Благодарение на ефективното противовъзпалително и антиоксидантно действие на селена, няколко проучвания разкриват връзката между DM и серумни нива на селен. Предишни проучвания показват, че по-високото ниво на селен е свързано с по-нисък риск от развитие на T2DM [16, 17, 18]. Интересното е, че Se-NP имат вътрешен хипогликемичен ефект наред с антиоксидантните и противовъзпалителните си действия, така че T1DM и T2DM могат да бъдат лекувани със Se-NP чрез облекчаване на оксидативния стрес и сенсибилизиращ инсулин [19].

В настоящото проучване ние подготвихме Se-NPs с едноетапен метод чрез редуциране на натриев селенит с аскорбинова киселина. За да се предотврати агрегирането на частиците и да се подобри стабилността, декстринът е въведен в редокс системата. Благодарение на тяхната висока бионаличност, ниска токсичност и нови терапевтични свойства, Se-NP са признати като обещаващ инструмент за лекарствени терапии при T2DM. В това проучване ние разработихме нови терапевтични стратегии за T2DM, за да изясним потенциалната роля на приложението на две дози Se-NP и/или Se-NP, комбинирани с MET, за да изследваме дали Se-NP могат да показват антидиабетна активност, или дори да подобри терапевтичния ефект in vivo. Също така, ние оценяваме модулаторната роля на Se-NPs за подобряване на окислителното увреждане в чернодробната тъкан на HFD/STZ-диабетични плъхове, както и възстановяване на антиоксидантната защитна способност. Освен това изследваме дали пероралното приложение на Se-NPs и MET може да забави появата на IR, вероятно чрез въздействие върху инсулиновия сигнален път и възпалителния път.

материали и методи

Материали и химикали

Изолационни реактиви на TRIzol RNA (Каталожен № 15596026, Invitrogen). Комплект EXPRESS SYBR GreenER в една стъпка, универсален (Каталожен № 11780200, Invitrogen). Третирана с DEPC вода (Каталожен № D5758), Triton X100 (CAS № 9002-93-1), STZ (бял до жълт прах, CAS № 18883-66-4). HEPES, Trypan Blue и MTT (Sigma-Aldrich, САЩ). Фетален говежди серум, RPMI-1640, буферен разтвор на HEPES, L-глутамин и гентамицин (Lonza, Белгия). Праймерните последователности (изсушени в 2 ml туба с винтова капачка) са получени от Sigma-Aldrich, САЩ. Включени антитела, [anti-AKT1 (NBP2-01724) или anti-AKT1-p ser473 (NBP2-35349)], [anti-GSK-3β (MAB2506) или anti-GSK-3β-p Ser9 (NB100-81948)], [анти-IRS1 (NB100-82001) или анти-IRS1-p Tyr612 (NBP1-73967)], [анти-AMPK алфа (MBS835324)], [анти-AMPK-алфа-p T172 (MBS462009)] [анти- p65-p Ser536 (NB100-82088)], [анти-COX2 (NB100-689)] и [анти-β-актин (NB600-501)]. TNF-α (Каталожен номер: MBS355371), iNOS (Каталожен номер: MBS723326). IL-6 (Каталожен номер: MBS355410), IL-1β (Каталожен номер: MBS825017), AGE (Каталожен номер: MBS774145) и Плъх инсулин (Каталожен номер: MBS760915) комплекти за анализ са доставени от Mybiosource (Сан Диего, Калифорния, САЩ) . MET таблетка (500 mg) е закупена от Eva Pharma, Египет. Разтворители и други свързани биохимични реагенти, включително натриев селенит, натриев додецил сулфат, Tween 20 и други често използвани реагенти са получени от висококачествени от Sigma-Aldrich, САЩ.

Подготовка на Se-NP

Синтезът на Se-NPs се извършва съгласно метода, описан от Qian Li et al. [26] с някои модификации. Приготвят се изходни разтвори на натриев селенит (100 тМ) и аскорбинова киселина (50 тМ). Реагиралите съотношения на натриев селенит към аскорбинова киселина варират (1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5 и 1: 6) от основния разтвор. При магнитно разбъркване разтворът на аскорбинова киселина се добавя на капки към разтвора на натриев селенит за 30 минути при стайна температура. След това смесите се оставят да реагират, докато се наблюдава промяна на цвета от безцветен в светлочервен. След това сместа се разрежда до 25 ml, като се използва вода Milli-Q.

Покритие на Se-NP

Приготвените по-рано Se-NP са покрити с декстрин в концентрация (5%), който се добавя след появата на цвят с помощта на магнитна бъркалка при стайна температура, използвайки метод на еднослойно покритие. Приготвените наночастици се разреждат, като се използва разтвор на декстрин, вместо да се добавя вода. Накрая, наночастиците се измиват и сушат с помощта на лиофилизатор. Приготвените наночастици се характеризират с използване на ТЕМ.

Предавателен електронен микроскоп (TEM)

Se-NPs бяха подготвени за ТЕМ анализ чрез поставяне на капка суспензия от наночастици върху медни решетки с въглеродно покритие. Под инфрачервена лампа пробите бяха изсушени и след това изображенията бяха записани с помощта на инструмент TEM Philips CM 200 с работно напрежение при 80 KV и разделителна способност до 2,4 Aᵒ.

Изследване на цитотоксичността

Клетъчна линия и поддръжка.

Мъжки плъхове Sprague-Dawley (200–250 g) са получени от дома за животни на Центъра за медицински технологии, Александрийски университет. Изолирането на хепатоцити се извършва съгласно перфузията на колагеназата, описана от Reese and Byard [27]. Хепатоцитите (1 х 106 клетки/ml) се поставят в буфер на Krebs-Henseleit (рН, 7.4), съдържащ 12.5 mM HEPES и се държат при 37 ° С с 95% O2 и 5% CO2. В експериментите са използвани хепатоцити с жизнеспособност над 90%, измерени с Trypan Blue [28].

Анализ на цитотоксичността.

Ин витро антиоксидантна биоактивност на Se-NP

DPPH радикална активност за почистване.

Анализът на DPPH беше продължен, за да покаже активността на извличане на свободните радикали на синтезираните Se-NPs, използвайки метода, описан от Patel Rajesh и Patel Natvar [29] с някои модификации. Разтворът на DPPH се добавя към серийните концентрации на синтезирани Se-NPs и стандартна аскорбинова киселина след приготвяне (0,25, 0,5, 1, 1,5 и 2 mg/ml) и се разрежда с метанол. След 15 минути абсорбцията се отчита при 517 nm, като се използва метанол като заготовка. Също така, за контролно отчитане, 150 μl разтвор на DPPH се добавя към 3 ml метанол и абсорбцията се взема незабавно при 517 nm. Изчисляването на активността на извличане на радикали DPPH се извършва по следната формула:

% почистване =, където A0 е абсорбцията на контролата, а A е абсорбцията на тестовата проба.

БЕЗ радикална активност за почистване.

НЯМА активност по изчистване по метода на Sreejayan и Rao [30]. Серийни концентрации на синтезирани Se-NPs, както и аскорбинова киселина (стандартна) 0,25, 0,5, 1, 1,5 и 2 mg/ml, бяха приготвени и разтворени в DMSO и 2,0 ml натриев нитропрусид (10 mM) във фосфатен буферен физиологичен разтвор добавя се към всяка и се инкубира в продължение на 150 минути при стайна температура. След инкубацията към всички епруветки, включително контролата, бяха добавени 5 ml реактив на Griess. Абсорбцията е измерена при 546 nm на UV-видимия спектрофотометър; като празна проба се използва метанол. Процентът на дейността по изчистване е изчислен, както е обяснено по-горе.

Извличане на водороден пероксид.

Способността на Se-NPs да чистят водороден прекис беше изследвана спектрофотометрично [31]. Различни концентрации на синтезирани Se-NPs, както и аскорбинова киселина (стандартна) 0,25, 0,5, 1, 1,5 и 2 mg/ml, бяха добавени към 0,6 ml разтвор на водороден пероксид (2 mM), приготвен във фосфатен буфер, рН, 7,4. Абсорбцията се измерва спрямо празен разтвор (фосфатен буфер) при 230 nm и се сравнява с аскорбиновата киселина (стандарт). Процентът на ефекта на почистване на водороден пероксид се изчислява, както е обяснено по-горе.

Анализ за намаляване на мощността.

Редуциращата мощност на Se-NPs се определя по метода на Yildirim et al. [32]. Различни концентрации на синтезирани Se-NPs, както и аскорбинова киселина (0,25, 0,5, 1, 1,5 и 2 mg/ml) се смесват с 2,5 ml фосфатен буфер (0,2 M) и 2,5 ml калиев ферицианид (1%). Сместа от Se-NPs и аскорбинова киселина се инкубира в продължение на 20 минути при 50 ° С. След охлаждане към смесите се добавят 2,5 ml трихлороцетна киселина (10%) и се центрофугират в продължение на 10 минути при 3000 rpm. 2,5 ml от супернатантата се смесва с 0,5 ml прясно приготвен FeCI3 (0,1%). След това абсорбцията се измерва при 700 nm. Процентът на анализа на редуциращата мощност се изчислява, както е обяснено в анализа на DPPH.

Анализ на общия антиоксидантен капацитет.

TAC анализът на Se-NPs се определя по стандартен метод на Umamaheswari и Chatterjee [33]. Различни концентрации на Se-NPs и аскорбинова киселина (0,25, 0,5, 1, 1,5 и 2 mg/ml) бяха добавени към 1,0 ml от разтвора, съдържащ сярна киселина (0,6 M), натриев фосфат (28 mmol) и амониев молибдат (4,0 mmol). Смесите се инкубират в продължение на 90 минути при 95 ° С. Абсорбцията се измерва след охлаждане при 695 nm. Инхибирането се изчислява, както е обяснено в анализа на DPPH.

Експериментални животни

Експериментален дизайн

Шест контролни групи без диабет, получаващи нормална диета, бяха разделени, както следва: