Джефри Дж. Марковиц

1 катедра по неврология и медицина за развитие, Балтимор, MD, САЩ 21205

различни

Шилпа Д. Кадам

1 катедра по неврология и медицина за развитие, Балтимор, MD, САЩ 21205

2 катедра по неврология, Институт Кенеди Кригер, Балтимор, MD, САЩ 21205

3 катедра по неврология, Балтимор, MD, САЩ 21205

Дани Р. Смит

5 Център по неврогенетика и поведение, Департамент по психологически и мозъчни науки, Университет Джон Хопкинс, Балтимор, MD, САЩ 21218

Майкъл В. Джонстън

1 катедра по неврология и медицина за развитие, Балтимор, MD, САЩ 21205

2 катедра по неврология, Институт Кенеди Кригер, Балтимор, MD, САЩ 21205

3 катедра по неврология, Балтимор, MD, САЩ 21205

4 катедра по педиатрия, медицина Джон Хопкинс, Балтимор, MD, САЩ 21205

Ан М. Коми

1 катедра по неврология и медицина за развитие, Балтимор, MD, САЩ 21205

3 катедра по неврология, Балтимор, MD, САЩ 21205

4 катедра по педиатрия, медицина Джон Хопкинс, Балтимор, MD, САЩ 21205

Свързани данни

Резюме

1. Въведение

Неонаталният инсулт се среща при приблизително едно от 4000 раждания (Lynch et al., 2002) и около 75% от тях имат последствия, включително церебрална парализа, епилепсия, проблеми с ученето и паметта и когнитивни увреждания (Koelfen et al., 1995; Delsing и др., 2001). Неонаталният и педиатричният инсулт често се проявяват с гърчове и появата на гърчове корелира с тежестта на неврологичните резултати (Aden et al., 2002). Прилагането на антиконвулсанти е често срещана стратегия за лечение в тези случаи; следователно оценката на антиконвулсантите като невропротективни агенти е била област на активни изследвания (Trojnar et al., 2002; Calabresi et al., 2003; Leker and Neufeld, 2003; Liu et al., 2004; Traa et al., 2008).

Последните доклади (Bittigau et al., 2003; Stefovska et al., 2008) демонстрират вредни ефекти след антиконвулсантно приложение при пренатални и новородени (постнатален ден 0 - постнатален ден 14) гризач по време на периода на развитие, съответстващ на мозъчния растеж спринт (Dobbing and Sands, 1973). При антиконвулсантни концентрации се съобщава за драстично повишена апоптоза и клетъчната пролиферация намалява в незрелия мозък след приложение на няколко AED, включително фенобарбитал (Bittigau et al., 2003; Glier et al., 2004; Manthey et al., 2005; Schubert et al. ., 2005; Kim et al., 2007; Stefovska et al., 2008). Доказано е, че невротропините и сигналните пътища за насърчаване на оцеляването са регулирани надолу (Bittigau et al., 2003; Hansen et al., 2004; Shi et al., 2010). Поведението също е засегнато: фенобарбиталът по-специално е показал, че индуцира поведенчески дефицит няколко месеца по-късно след 4 дози в неонаталния период (Stefovska et al., 2008). Тези ефекти са зависими от дозата, с прагови дози, над които са предизвикани вредни ефекти (Bittigau et al., 2003; Hansen et al., 2004; Shi et al., 2010).

Следователно притесненията относно ефективността, безопасността и способността за подобряване на резултата на антиконвулсанта ни подтикнаха да изследваме фенобарбитал в постнаталния ден 12 (P12) CD1 миши модел на неонатален инсулт. Доказано е, че този модел предизвиква остри поведенчески припадъци, функционални дефицити, нарушена неврогенеза и мозъчно увреждане (Comi et al., 2004; Kadam et al., 2008; Kadam et al., 2009a; Kadam et al., 2009b). Тук докладваме въздействието на единична остра доза фенобарбитал (30 mg/kg или 60 mg/kg) върху тези крайни точки след инсулт в незрелия мозък.

2. Методи

Всички материали и методи са одобрени от Комитета по грижа и употреба на Университета Джон Хопкинс. Котилата на CD1 мишки са закупени от Charles River Laboratories Inc. (Wilmington, MA). Малките бяха настанени в поликарбонатни клетки с язовира на 12-часов цикъл светлина: тъмно; храна се предоставяше ad libitum. Фенобарбитал (PB; Sigma-Aldrich Co., Сейнт Луис, МО, САЩ) се разтваря до 25 mg/ml в стерилен dH2O. Малките от 14 котила бяха разпределени на случаен принцип в групи за лечение след лигиране (вижте Таблица 1 за подробности). За изследвания на серумна концентрация са използвани общо 4 носилки. Малките се претеглят при P12, P18, P19, P33 и P40. Изследователите бяха заслепени за лечебни групи.

маса 1

Мишки, използвани за изследвания на каротидно лигиране

30 mg/kg PB 60 mg/kg PB
Лигирано и произволно
404246
разпределени във всяка група, n
Жени, n (%)18 (45)21 (50)22 (48)
Мъже, n (%)22 (55)21 (50)24 (52)
Смъртност - жени, n004
Смъртност - мъже, n634
Оцелял до перфузия, n343938
Наранени жени, n (%)12 (35)15 (38)11 (29)
Наранени мъже, n (%)10 (29)9 (23)9 (24)
Ненаранени жени, n (%)6 (18)6 (15)7 (18)
Ненаранени мъже, n (%)6 (18)9 (23)11 (29)

2.1. Хирургия

На сутринта на P12, животните претърпяха постоянно едностранно двойно лигиране на каротидната артерия, както беше публикувано по-рано (Kadam et al., 2009b). Веднага след това се измерват ректалните температури, след което се прилага единична интраперитонеална доза (30 mg/kg или 60 mg/kg PB или 0,9% NaCl) и малките се поставят в инкубатор 37 ° C за наблюдение и оценка на припадъците. Ректалните температури също бяха взети 2 и 4 часа след лигирането.

2.2. Оценяване на остър припадък

Активността на припадъците се оценява по скала за оценка на припадъците, както беше съобщено по-рано (Comi et al., 2004; Kadam et al., 2009b). След 4 часа мишките бяха върнати на язовира и всеки от резултатите от пристъпите им беше индивидуално сумиран, за да се получи общ резултат за припадъци.

2.3. Администриране на 5-бромо-2’-дезоксиуридин

От P18-P20 мишките получиха 5 интраперитонеални инжекции от 50 mg/kg 5-бромо-2’-деоксиуридин (BrdU), аналог на тимидин, разтворени в 0,9% NaCl.

2.4. Поведенчески тестове

Всички поведенчески тестове са проведени между P32-P37.

2.4.1. Спонтанно редуване на Т-лабиринта

Тази процедура е проведена в затворен „Т“ образен лабиринт за общо 15 опити, както е описано по-рано (Kadam et al., 2009b). Ако мишката не е направила избор в рамките на 2 минути, пробният период е приключил и е преминал към следващия. В края на всяко изпитание лабиринтът се почиства от урина и изпражнения. По време на анализа на тези данни една мишка, ранена от инсулт, третирана с превозно средство, беше изключена, тъй като не би изпълнила задачата, т.е. при всяко от 15-те изпитания мишката не е влязла в нито едно от целевите рамена на лабиринта в рамките на определените минутен период, като по този начин не завършва нито едно от изпитанията.

2.4.2. Привикване на открито поле

Тестването беше проведено в квадратна открита камера, както беше описано по-рано, за да се изследват нивата на активност в два последователни дни и да се анализира привикването в рамките на и между сесиите (Kadam et al., 2009b). Данните за броя на задните части и времето, прекарано в отглеждане, бяха анализирани през първите 15 минути от първата сесия, за да се изследва това поведение независимо от привикването.

2.4.3. Тестване на нови обекти

Първите 2 дни мишките бяха оставени да привикват до квадратното поле, използвайки процедурите на открито, описани по-горе в раздел 2.4.2. На третия ден, във фазата на пробата, два идентични обекта бяха поставени от противоположните страни на арената и на еднакво разстояние от стените. Мишките бяха поставени в центъра на откритото поле и им беше оставено 10 минути за изследване. След това всяка мишка беше върната в домашната клетка за 3-минутен интерфазен интервал, през който един от обектите беше заменен с неидентичен обект; след това мишките бяха върнати на открито поле и им бяха дадени 10 минути за изследване (тестова фаза). Времето, в което всяка мишка е взаимодействала с всеки обект, е записано: Време за проучване на нов обект/(Време за изследване на нов обект + Време за изследване на познат обект) количествено предпочитание на обекта.

2.5. Перфузия

На P40 мишките се анестезират с 90 mg/kg хлорален хидрат, перфузират транскардиално с PBS, последван от фосфатно буфериран 10% формалин, и мозъците им след това се фиксират в същия фиксатор, криозащитени и бързо замразени и съхранявани при -80 ° C.

2.6. Имунохистохимия

Общо 66 мозъка (n/n = 66/80) от 8 котила (котила 7 до 14) бяха оцветени за BrdU и невронални ядра (NeuN) (n = 13 на група за ранени от лигиране; 7-12 на група за лигиране невредимо). Извличането на антиген се извършва с 10 mM натриев цитрат, рН 6.0, с 0.5% Triton-X 100. BrdU (Roche, 1170376) и NeuN (Chemicon, MAB377) IHC и количественото определяне се извършва, както е съобщено по-рано (Kadam et al., 2008). Слайдовете бяха изследвани с конфокален микроскоп Olympus (Fluoview), използвайки конфокалната система FV 1000, базирана на стойка за инвертиран микроскоп Olympus IX81. Брой на BrdU-положителни и BrdU/NeuN ко-маркирани клетки бяха извършени на серийни коронални сечения (атласът координира брегма -1,34 мм до брегма -2,06 мм) (Paxinos и Franklin, 2001).

2.7. Хистология и измерване на атрофия

С помощта на MCID 7.0 Elite (InterFocus Imaging Ltd., Кеймбридж, Обединено кралство) бяха измерени полусферични и хипокампални зони с дебелина 40µm, оцветени по Нисъл серийни коронални участъци, еднакво разположени и обхващащи ростралния стриатум до опашния хипокампус (n≥15 секции на животно) като описано по-рано (Kadam et al., 2009b). Хипокампалната и полусферичната атрофия се изчислява за всяка секция като (1 - (зона с ранена страна/зона с невредима страна)) × 100%. Наличието на инсулт-нараняване се определя чрез микроскопска инспекция при 4Х и 10Х за наличие или отсъствие на инфаркт, атрофични деформирани структури, глиоза или загуба на пирамидални клетки в хипокампуса. Dentate gyri бяха очертани за участъци, за които бяха извършени преброявания на BrdU-положителни и NeuN-положителни клетки, и плътността на BrdU-положителни клетки в зъбната извивка (DG) беше изчислена за всяка секция като (Брой на BrdU-положителни клетки в DG/DG площ в mm 2).

2.8. Серумни концентрации - приложение на лекарства, събиране на проби и анализ

Отделна кохорта от P12 CD1 мишки се инжектира интраперитонеално с 30 mg/kg или 60 mg/kg фенобарбитал и проби, събрани и анализирани, както е публикувано по-рано (Markowitz et al., 2010). Обемите кръв от две мишки се събират, за да се получи всяка проба (Таблица 2).