Лабораторно изследване

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Промените в минералния метаболизъм в резултат на бъбречна недостатъчност неизбежно водят до развитие на метаболитно костно заболяване. Бъбречната остеодистрофия е общ термин, обхващащ както високи, така и ниски оборотни форми на бъбречно костно заболяване. [1–4] Вторичният хиперпаратиреоидизъм (sHPTH) и остеит фиброза принадлежат към предишната група, докато остеомалацията и адинамичното костно заболяване се характеризират с ниско състояние на костен обмен. Между тези две групи пациентите могат да имат нормална хистология или смесена лезия, показваща характеристиките както на остеомалация, така и на хиперпаратиреоидизъм.

фосфор

Наличието на подходящи животински модели за човешки заболявания е от съществено значение за проучване на причините и терапевтичните и превантивни мерки на бъбречната остеодистрофия, както и за разработването на нови лекарства за лечение на различните костни лезии. Разработени са различни експериментални модели за индуциране на ХНН при лабораторни животни. [5] Най-широко използваните методи се основават на резекция на различни количества бъбречен паренхим. Процедурата, известна като 5/6-ти модел на нефректомия при плъхове, наричан още модел на „бъбречен остатък от плъх“, е разработена от Chanutin и Ferris. [6] Този модел е широко използван за оценка на патофизиологичните аспекти на ХНН, [7-11], но е и най-често използваният модел за изследване на костни промени, дължащи се на уремия. [12–19] Поразително е, че литературните данни показват, че с този модел се постига различна степен на вторичен хиперпаратиреоидизъм, което прави сравненията между различни изследвания и екстраполация на човешката ситуация често трудни. Основните причини за това са липсата на стандартизация по продължителност и степен на бъбречна недостатъчност и диетично съдържание на фосфор/бионаличност между различните проучвания.

За изследването на развитието на sHPTH при животни с ХНН е важно не само съдържанието на фосфор в храната, но и бионаличността на фосфора. Бионаличността на диетичния фосфор силно зависи от формата, в която елементът се среща в диетата. Поради последните разпоредби на властите на ЕС костното брашно вече не може да се използва като фосфорен източник на чау от плъхове. Поради това повечето доставчици променят рецептата на диетата на плъхове и мишки и преминават към вегетариански източници на фосфор (например пшеница). Те обаче могат да съдържат относително големи количества фитинова киселина, която представлява слабо до почти не бионаличен източник на фосфор и е известно, че образува много стабилни комплекси с минерални йони, сред които фосфат, което ги прави недостъпни за чревно усвояване. [20–22] По този начин химичният анализ на диетата може да даде концентрации на фосфор, които напълно съответстват на тези, докладвани от производителя, но не дава никаква информация относно неговата бионаличност. Изглежда, че този важен въпрос не е взет под внимание в по-голямата част от експериментални проучвания, занимаващи се с минерален метаболизъм и костни заболявания.

Експериментът, описан в тази статия, е предназначен да оцени ефекта от използването на различен фосфорен източник в диетата на CRF плъхове върху развитието на sHPTH, както и ефекта от вариациите в уремичното състояние върху развитието на това костно разстройство в остатъчния бъбречен модел плъх.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Експериментален дизайн

Биохимични и химични анализи

Хистология на костите

При жертва бедрените кости и пищялите бяха освободени от меките тъкани. Дясната пищял се използва за хистологично изследване след 24-часово фиксиране в разтвора на Burkhardt и последващо прехвърляне в 70% етанол до по-нататъшна обработка. След това костните проби бяха вградени в 100% метилметакрилат. Надлъжните разрези (5 μm) на проксималната пищял бяха изрязани с микротом JUNG K и оцветени съгласно Goldner за описателна хистология. Хистологичните данни за костите, както и динамичните параметри, се отчитат чрез стандартизирана номенклатура и дефиниции [25] и са измерени с помощта на полуавтоматична система за обработка на изображения (Kontron KS400). Измерените параметри включват обща костна площ (BAR), остеоидна площ (OAR), остеоидна ширина (OWI), остеоиден периметър (OPM), ерозиран периметър (EPM), остеобластен периметър (OBPM), остеокластен периметър (OCPM), двойно маркирани периметър (DLPM), скорост на утаяване на минерали (MAR), време на забавяне на минерализацията (MLT) и скорост на костно образуване (BFR).

Статистика

Статистическият анализ на данните е направен с помощта на теста на Крускал-Уолис и теста на Ман-Уитни за несдвоени сравнения, последван от корекция на Bonferroni, когато са сравнени повече от две групи. Връзката между две стойности е оценена чрез линейната корелация на Пиърсън. A стр значение Ролята на диетичния фосфор и степента на уремия в развитието на бъбречна костна болест при плъхове

Публикувано онлайн:

Фигура 1. Еволюция във времето на (A) телесно тегло, (B) прием на храна и (C) серумен креатинин с течение на времето при бъбречна недостатъчност (CRF) и контролни (SHAM) животни, които са били хранени или със стандартна диета (STD), или с високо съдържание на фосфор диета (HPD). а: стр та нефректомия показва, че е предизвикана умерена степен на бъбречна недостатъчност, която е сравнима между STD и HPD групите (вж. фигура 1С). По време на 12-седмичния период на изследване, серумните нива на креатинин са били повишени 1,8 пъти в групата със STD и 2,1 пъти в групата с HPD. Наличието на бъбречна недостатъчност се доказва допълнително от зависеното от времето покачване на протеинурията от 9,6 ± 3,1 mg/24h преди CRF до 126,4 ± 63,8 mg/24h след 12 седмици уремия (при всички CRF животни взети като една група).

Значително по-ниско количество на калцемия и калциурия е отбелязано както при CRF, така и при фалшиво оперирани животни, които са получили HPD, в сравнение с тези, които са били хранени със STD (вж. Фигура 2А и С). В края на периода на изследване CRF животните от групата на HPD са имали значително по-висока фосфатемия в сравнение с групата NP (виж Фигура 2В). Фосфатурията е забележително ниска при всички плъхове, хранени със STD през целия 12-седмичен период на изследване (вж. Фигура 2D).

Публикувано онлайн:

Фигура 2. Развитие във времето на (A) серумен калций, (B) серумен фосфор, (C) калциурия и (D) фосфатурия при животни с бъбречна недостатъчност (CRF) и контролни (SHAM), които са били хранени или със стандартна диета (STD), или с диета с високо съдържание на фосфор (HPD). а: стр Роля на диетичния фосфор и степен на уремия в развитието на бъбречно-костна болест при плъхове

Публикувано онлайн:

Фигура 3. Еволюция във времето на (A) серумен PTH, (B) серумен остеокалцин, (C) серумен TRAP и (D) дезоксипиридинолин концентрация при бъбречна недостатъчност (CRF) и контролни (SHAM) животни, които са били хранени или със стандартна диета (STD) или диета с високо съдържание на фосфор (HPD). а: стр Роля на диетичния фосфор и степен на уремия в развитието на бъбречно-костна болест при плъхове

Публикувано онлайн:

маса 1 Костни хистоморфометрични и хистодинамични параметри на различните изследователски групи при жертва 6 и 12 седмици след операцията

Храненето с HPD е довело до увеличаване на костния обмен, както при контрола, така и при CRF животните. Фалшиво оперираните животни, които са получили HPD, са имали по-високи BFR, MAR и DLPM и по-ниски MLT и OMT в сравнение с фалшивите, които са получили STD, особено на 12-та седмица (вж. Таблица 1). Подобна, макар и по-изразена тенденция се наблюдава при CRF животните.

Различни хистологични признаци на вторичен хиперпаратиреоидизъм (т.е. по-високо костно образуване - повишена BFR, MAR, DLPM, OBPM) в комбинация с по-високи параметри на костна резорбция (т.е. по-висок EPM) (вж. Таблица 1) са наблюдавани само при CRF животни, получаващи HPD . Ефектът е значително по-изразен след 12 седмици уремия. По това време костната площ също е значително увеличена, което показва, че по това време BFR трябва да е надвишила скоростта на костна резорбция (вж. Таблица 1). В групата с HPD фиброза на костния мозък се наблюдава при 26% от животните (данните не са показани).

Ефект от степента на бъбречна недостатъчност

Тъй като животинските модели на CRF, включително моделът на „плъхове с остатъчен бъбрек“, са склонни към значителни вариации в бъбречната функция, степента на бъбречна недостатъчност е повлияла развитието на sHPTH при плъхове, получаващи двете различни диети. Въз основа на серумните концентрации на креатинин, всички плъхове са разпределени в една от трите групи: нормална бъбречна функция (т.е. серумен креатинин ≤ 0,6 mg/dL), лека бъбречна недостатъчност (т.е. серумен креатинин> 0,6 и ≤ 1,0 mg/dL), и умерена бъбречна недостатъчност (т.е. серумен креатинин> 1,0 mg/dL). От CRF плъховете, които са били жертвани след шест седмици уремия, 58% са имали лека и 42% са имали умерена бъбречна недостатъчност. От CRF животните, които са били жертвани след 12 седмици, 42% са имали лека и 58% са имали умерена бъбречна недостатъчност (за броя на животните във всяка група, вижте Таблица 2).

Публикувано онлайн:

Таблица 2 Ефект на бъбречната функция върху костните хистоморфометрични и хистодинамични параметри на различните изследователски групи

Биохимия на серума и урината

Животните с умерена бъбречна недостатъчност, получаващи HPD, са имали значително по-ниска калцемия (вж. Фигура 4А) и по-висока фосфатемия (фигура 4В) в сравнение с плъхове с нормална бъбречна функция или лека бъбречна недостатъчност. Уремичният статус няма ефект върху тези параметри при плъховете от STD групата. В групата с HPD отделянето на Ca с урината се увеличава с по-изразено бъбречно увреждане, но е значително по-ниско в сравнение с групата със STD (вж. Фигура 4C). Фосфатурията е значително по-висока при всички животни, получаващи HPD, независимо от тежестта на бъбречната недостатъчност (вж. Фигура 4D).

Публикувано онлайн:

Фигура 4. Ефект на бъбречната функция върху (A) серумен калций, (B) серумен фосфор, (C) калциурия и (D) фосфатурия при животни, хранени със стандартна диета (STD) или диета с високо съдържание на фосфор (HPD). х: стр Роля на диетичния фосфор и степен на уремия в развитието на бъбречно-костна болест при плъхове

Публикувано онлайн:

Фигура 5. Ефект на бъбречната функция върху (A) серумен PTH, (B) серумен остеокалцин, (C) серумен TRAP и (D) концентрация на дезоксипиридинолин при животни, хранени със стандартна диета (STD) или диета с високо съдържание на фосфор (HPD). х: стр Роля на диетичния фосфор и степен на уремия в развитието на бъбречно-костна болест при плъхове

Публикувано онлайн:

В HPD, предоставен от Sniff, към диетата се добавят неорганични фосфорни източници с висока скорост на усвояване (например монокалций-фосфор). Добрата бионаличност на фосфор в тази диета се доказва от факта, че животните, получаващи тази храна, са имали значително по-високи концентрации на фосфор в урината в сравнение с плъховете, получаващи STD. Въпреки че по-рано диета с високо съдържание на фосфор е била използвана за индуциране на вторичен хиперпаратиреоидизъм при плъхове с бъбречна недостатъчност, [26] това е първото проучване, в което се сравняват хистологичните параметри на костите при животни, хранени с диета с нисък или висок бионаличен фосфор. Развитието на sHPTH след зареждане с фосфор може да се отдаде на кумулативния ефект на различни фактори:

директен ефект на хиперфосфатемия върху синтеза и секрецията на PTH, [27–29]

намаляване на калцитриола, [33], [34] и

намален отговор на калцемия към PTH. [31], [34–36]

Доказано е, че диетичното ограничение на Р предотвратява напълно индуцирания от уремия растеж на паращитовидните клетки и подобрява вторичния хиперпаратиреоидизъм при уремични кучета [37] и плъхове. [38]

Развитието на sHPTH се доказва допълнително хистологично от повишен костен обмен (както по-високо костно образуване, така и параметри на костна резорбция) при тези животни. За разлика от плъховете от групата STD, увеличеното количество остеоид в CRF плъховете в сравнение с контролите на групата HPD не трябва да се дължи на развитието на минерален дефект. По-скоро в присъствието на повишена остеобластична активност, по-високата MAR и по-ниската MLT в групата на HPD CRF в комбинация с нормален OMT са показателни за непокътната минерализация. По този начин плъховете, получаващи HPD, имат ускорено отлагане на остеоиди, причинено от повишена остеобластична активност, която става лесно зряла и минерализирана. След 12 седмици уремия, това води до значително увеличаване на костната площ (остеоидна зона + минерализирана област) в сравнение с плъхове, които се хранят със STD (вж. Таблици 1 и 2).

За да се проучи ефектът от тежестта на бъбречното увреждане върху развитието на sHPTH, животните бяха разделени в три групи: плъхове с нормална бъбречна функция, лека бъбречна недостатъчност и умерена бъбречна недостатъчност. Само плъховете с умерена бъбречна недостатъчност, получаващи HPD, са развили изразен sHPTH. Всъщност само тези животни са имали повишена концентрация на iPTH, скорост на образуване на кост, остеобластична активност, костна резорбция и наличие на фиброза. Изглежда, че степента на бъбречната недостатъчност, а не продължителността на уремията, трябва да се счита за важен фактор за развитието на sHPTH.

Интересното е, че храненето с HPD на плъхове с нормална бъбречна функция също води до увеличаване на образуването на кости: подправените животни, които са били хранени с HPD, са имали по-високи BFR, DLPM и MAR и по-ниски MLT в сравнение с бутаните, които са получили STD, въпреки липсата на каквато и да е разлика в концентрациите на PTH. Това може да означава, че фосфорът може да действа като независим стимул на костния обмен. [43]

В заключение, данните от това проучване представят доказателства, че остатъчният бъбречен плъх може да се счита за подходящ модел за развитието на sHPTH, при условие че степента на бъбречна недостатъчност и фосфорното натоварване са достатъчни. По отношение на последното трябва да се има предвид не само съдържанието на фосфор в храната, но и неговата бионаличност, отразена от фосфатурията, за да се получат надеждни и възпроизводими резултати.

ПРИЗНАВАНИЯ

Л. Осте е получател на стипендия за следдипломно изследване на Фламандския институт за насърчаване на научните технологични изследвания в индустрията (IWT).

маса 1 Костни хистоморфометрични и хистодинамични параметри на различните изследователски групи при жертва 6 и 12 седмици след операцията