Jinrong Zeng

1 Департамент по дерматология, Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Ли Лей

1 Департамент по дерматология, Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Цинхай Дзен

1 Департамент по дерматология, Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Юин Яо

2 Медицинско училище XiangYa, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Yuqing Wu

2 Медицинско училище XiangYa, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Qinxuan Li

2 Медицинско училище XiangYa, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Лихуа Гао

1 Департамент по дерматология, Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Хонгдзяо Ду

1 Департамент по дерматология, Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Yajie Xie

1 Катедра по дерматология, Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Джинхуа Хуанг

1 Катедра по дерматология, Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Уенбин Тан

3 Катедра по клетъчна биология и анатомия, Медицински факултет, и

4 Катедра по биомедицинско инженерство, Колеж по инженерство и изчисления, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина

Jianyun Lu

1 Департамент по дерматология, Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;

Свързани данни

Резюме

Въведение

За първи път озонът се прилага клинично като стерилизиращо средство поради силното си окислително свойство. Той е широко използван за лечение на повече от 50 различни патологични състояния, включително инфекциозни кожни заболявания 15 - 18, алергични заболявания 19, 20, еритемни люспести заболявания 21, 22, зарастване на рани и възстановяване на язва 23. Механизмите на действие на озона могат да бъдат в основата на антимикробните ефекти, имунорегулацията, антиоксидантната защита, епигенетичната модификация, биосинтеза, аналгетиците и вазодилатацията 24. Настоящите озонови медицински препарати за дерматология попадат в следните основни класификации: озонова хидротерапия, локално озонирано масло, озонова автохемотерапия (OAHT) и озонова газова кухина/акупунктурна инжекция 24. Последните проучвания показват, че прецизният контрол на концентрациите на озон може да индуцира производството на различни цитокини, като IFN-γ, IL-6 и TNF-α 25. Озонът може да индуцира и активира антиоксидантната ензимна система на организма, за да произвежда средства за отстраняване на свободните радикали, да премахва някои от свободните радикали, генерирани от възпалителни реакции, и да пречи на производството на възпалителни фактори по време на развитието на заболяването 26. Точните механизми на озоновата терапия при лечение на заболявания обаче трябва да бъдат допълнително изяснени.

В това проучване ние оценихме терапевтичната ефикасност на краткосрочното лечение с озон за псориатични пациенти. Изследвахме потенциалните механизми на локалната озонотерапия за псориазис, използвайки имиквимод (IMQ) индуциран псориазис-подобен модел на мишка. Установихме, че озоновата терапия отслабва възпалителните реакции при псориазис чрез инхибиране на NF-κB пътя. Нашите резултати показват, че озоновата терапия е безопасно и ефективно лечение на псориазис и заслужава по-нататъшни клинични оценки и приложения.

Материали и методи

Пациенти

Това проучване беше одобрено от институционалния съвет за преглед (IRB) на Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай. Общо 10 пациенти с псориазис, диагностицирани с псориазис вулгарис, са били включени в проучването и всички лица са подписали писмени формуляри за съгласие. Клиничната информация за пациентите е показана в Допълнителна таблица 1. Резултатите от PASI са използвани за оценка на активността на заболяването. Критериите за включване в проучването са за пациенти на възраст между 18 и 60 години и с псориазис вулгарис, диагностициран при патологични изследвания. Критериите за изключване включват алергия към озонирана вода или масло; бременност или кърмене; тежки системни заболявания; и получили кортикостероиди, производни на витамин D3, имунни инхибитори, биологична терапия или перорални ретиноиди през последните 2 седмици.

Мишките BALB/c са закупени от Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. На възраст от 6 седмици, женските мишки са били адаптивно хранени в продължение на 1 седмица и използвани за всички експерименти. Всички животни се отглеждат и обработват в центъра за експерименти с животни в Централния южен университет в строго съответствие със съответните закони и институционални насоки. Всички процедури с животни бяха одобрени и контролирани от Комитета по грижа и употреба на животните в медицината към Трета болница Xiangya на Централния южен университет.

Локална озонотерапия

Всички участници бяха лекувани с озониран воден душ (3.0 ± 1.5 mg/L, HZ-2601B, Hunan Health Care Technology, Changsha, China) в продължение на 15 минути, веднъж на ден, след това третирани с локално озонирано масло (20160522, с приблизително пероксидна стойност от 2000-2,400 mmol-еквивалент/kg, Hunan Health Care Technology, Changsha, Китай) два пъти на ден, в продължение на 14 дни.

Оценка на клинични снимки и отражателни конфокални микроскопски изображения на кожни лезии

Всички субекти са получавали само безплатна озонова терапия; те не са получавали никакви други лечения и лекарства по време на изпитанието. Интервенцията продължи 14 дни. Клиничните снимки, PASI резултатите и RCM изображенията бяха оценени от същите професионални лекари, за да се оцени тежестта на заболяването преди и след леченията. Резултатите от PASI включват областта на кожни лезии, еритема, лющене и удебеляване, според литературата 27. Всеки субект беше оценен чрез RCM изображения от три различни места на кожни лезии. Общата RCM сканирана дебелина на кожата е 51 слоя × 3,05 µm (вертикално) във всеки слой. Под RCM, дебелината на епидермиса и инфилтрираните възпалителни клетки също бяха оценени преди и след лечението.

IMQ-индуциран модел на мишка на псориазис и озонова интервенция

Женски мишки BALB/c (на възраст 6-8 седмици) бяха хранени при подходящи условия. Мишките бяха намазвани ежедневно с 5% IMQ крем (Sichuan Med-Shine Pharmaceutical Co., Ltd., H20030128, Sichuan, China) върху обръснатите си гръбни кожи в продължение на 7 последователни дни. Мишките от контролната група бяха третирани със същото количество от крема на носителя. Всички IMQ мишки бяха разделени на случаен принцип в три групи: неинтервенционната група (IMQ група), групата за третиране на озон (IMQ + озон) и групата за третиране на крема (IMQ + Vehicle). Групата за обработка на озона се третира с озонирана вода (HZ-2601B, Hunan Health Care Technology Co., Ltd., Changsha, China) в продължение на 15 минути веднъж на ден, след което се третира с локално озонирано масло (20160522, Hunan Health Care Technology Co ., Ltd., Чанша, Китай). Групата за третиране на кремове за превозни средства получава вода от чешмата и базово масло със същата честота. Интервенцията продължи 7 дни. Клинични снимки и PASI резултати са събрани, за да се оценят фенотипните характеристики. На 7-ия ден всички мишки бяха жертвани за събиране на кожни лезии, тъкани на далака и лимфни възли.

Изолиране на CD4 + Т клетки

Мононуклеарните клетки от периферна кръв (PBMC) се отделят от периферната кръв на пациентите преди и след лечението чрез центрофугиране, като се използва среда с градиент на плътността (GE Healthcare, Чикаго, IL, САЩ). CD4 + Т клетки бяха изолирани чрез положителна селекция, използвайки мъниста Miltenyi, съгласно инструкциите на производителя (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия). След това изолираните CD4 + Т клетки се събират за последващи експерименти. В експеримента с мишки CD4 + Т клетките се пречистват от обединени едноклетъчни суспензии на далак, като се използва комплект за изолиране на CD4 + Т клетки на мишка от Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Германия).

Поточна цитометрия

Общата РНК се извлича от клетки или кожни тъкани, използвайки TRIzol, съгласно инструкциите на производителя (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). ИРНК се транскрибира обратно с комплекта за реагенти PrimeScript® RT (Takara Biomedical Technology Co., Ltd., Kusatsu, Shiga, Japan) с 1 μg обща РНК във всяка реакция. Реакционната смес за PCR в реално време съдържа 2 μL кДНК, 10 μL SYBR Premix Ex Taq ™ (Takara Biomedical Technology Co., Ltd., Kusatsu, Shiga, Япония) и 400 nM смислени и антисенс праймери за финал обем от 20 μL. QPCR беше извършен на термоциклер LightCycler ® 96 (Roche, Rotkreuz, Швейцария). Количеството генна експресия се изчислява, като се използват 2 -ΔCt методите и се нормализира до глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH). Грундовете са показани в допълнителна таблица 2.

Западно петно

CD4 + Т клетките се лизират и протеините се екстрахират с помощта на реактор за ядрена екстракция (Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA). Количествените белтъци се определят от реактива на Брадфорд (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), последвано от 12% вертикална додецил сулфатно-полиакриламидна гел електрофореза. След това протеините се прехвърлят в мембрана на поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО, САЩ). Мембраната PVDF се блокира в 5% обезмаслено мляко за 1 h при стайна температура, след което се инкубира с антитяло срещу P65 (GB11142, 1: 1000, Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China) или P50 (ab7971, 1: 5000, Abcam, Cambridge, MA, USA) за 12-16 часа при 4 ℃, и последвано от инкубация с миши анти-заешки IgG антитела (H&L) (GenScript, Piscataway, NJ, USA). Протеините бяха открити с усилен хемилуминесцентен (ECL) уестърн блот комплект за откриване (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Количественото определяне на P65 и P50 се нормализира до GAPDH чрез денситометрия.

Хистологичен анализ

Кожните тъкани от всички пациенти и мишки бяха фиксирани във формалин и вградени в парафин (Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Китай). Секции (6 µm) се оцветяват с хематоксилин и еозин и се съхраняват при стайна температура. Оценени са дебелината на епидермиса и инфилтриращите възпалителни клетки.

Имунохистохимично оцветяване

Секции (6 µm) бяха оцветени с антитела P50 (каталожен № BS1249, Bioworld Technology Co., Ltd., Нанкин, Китай), P65 (каталожен номер 10745-1-AP, Proteintech, Rosemont, IL, САЩ) и TLR2 антитела (каталожен номер ab213676, Abcam, Cambridge, MA, USA) съгласно инструкциите на производителя. Анализът на изображението беше извършен с помощта на флуоресцентен микроскоп и софтуер за анализ Leica Qwin Std (Leica, Wetzlar, Германия).

Последователност с висока производителност

Получени са транскриптомни профили на лявата и дясната страна на кожните лезии от модели за самоконтрол на мишки и лезии от гръбните кожи на мишката в контролната група и IMQ групата. Накратко, от тези кожни проби беше извлечена обща РНК; иРНК беше обогатена, фрагментирана и използвана за синтеза на кДНК. СДНК фрагментите бяха амплифицирани чрез PCR и размерът и качеството на секвенционната библиотека бяха определени с помощта на Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Библиотеката беше секвенирана с помощта на високопроизводителна платформа за секвениране HiSeq X Ten (Illumina Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ). Диференциално експресираните гени сред избраните проби бяха анализирани чрез анализ на обогатяването на пътя на Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Статистически анализ

медиирания

Локалното лечение с озон значително инхибира TLR2/NF-κB сигнализирането. а) Експресионните нива на TLR2, P50 и P65 при кожни лезии от групи Ctrl, IMQ, IMQ + Vehicle и IMQ + Озон бяха оценени чрез имунохистохимичен анализ. б) Нива на експресия на TLR2, P50 и P65 при IMQ-индуцирани самоконтролни лезии на кожата на мишката и (° С) лезии на псориазис при хора преди и след лечение с озон.

Потискане на диференциацията на Th17 чрез локално лечение с озон

Псориазисът е хронично рецидивиращо възпалително кожно заболяване. Ние твърдим, че озоновата терапия може да контролира прогресията на псориазиса чрез инхибиране на възпалителния отговор на кожните лезии. Проучванията са установили, че озонираното масло не само доставя реактивен кислород, но също така поддържа терапевтично активни озонирани производни за дълго време 38. Нашите предишни проучвания установиха, че озонираното масло е безопасно и ефективно за лечение на стабилен псориазис вулгарис, с ефикасност, еквивалентна на тази на междинно действащите глюкокортикоиди 39. В това проучване демонстрирахме, че псориатичните кожни лезии на пациентите се смекчават значително и че възпалителните биомаркери като IL-17a, IL-6, TNF-α, TGF-β и IFN-γ се понижават значително след лечение с озон. Ние също така показахме, че озоновата терапия може значително да инхибира свързаните с възпалението пътища, като NF-κB, TLR, TNF и IL-17, в псориазисен животински модел. Тези данни дават представа за механизмите, залегнали в основата на терапевтичните ефекти на озоновата терапия върху псориатичните лезии.

Активирането на Th17 клетки е от решаващо значение за възпалителния отговор на псориазис вулгарис лезии 51. Нашите резултати показват, че лечението с озон може значително да инхибира индуцираното от IMQ увеличение на броя и активната функция на Th17 клетките. Активирането на NF-кВ сигналния път може да предизвика активирането на Th17 клетки 52. Следователно, озоново-медиираното потискане на активирането на Th17 клетки вероятно се дължи на инхибирането на NF-кВ пътищата. В допълнение към Th17 клетките, други имунни клетки, като Th1, Th2, дендритни клетки (DCs), клетки на естествени убийци (NK) и макрофаги, също участват във възпалителния отговор на псориазис 53. Нашите резултати обаче показват, че лечението с озон има минимален ефект върху тези клетки. Следователно озонът има специфичен ефект върху регулирането на Th17 клетките по време на лечението на псориазис.

В допълнение към озонираната вода и нефт, озоновата автохемотерапия и озоновата газова кухина/инжектиране с акупунктура също са докладвани за подобряване на антиоксидантния капацитет на тялото и регулиране на възпалението 54 - 56 Все още не е установено дали тези лечения могат да се използват при псориазис. Озонът може да се използва и в комбинация с други агенти, за да се намалят страничните ефекти и да се увеличи ефикасността. Например, комбинираното интрадискално и перианглионално инжектиране на медицински озон и стероиди има кумулативен ефект, което води до подобрени общи резултати при лечението на болка, причинена от дискова херния 57. Местната озонотерапия има няколко странични ефекти, като дразнеща болка. Рядко предизвиква системни странични ефекти. В това проучване има някои ограничения. Например, няма данни относно дългосрочната ефикасност на лечението или неговото въздействие върху честотата на рецидиви. Все още не е отговорено на въпроса дали лечението с озон играе регулаторна роля при пролиферацията и диференциацията на кератиноцитите и при вазодилатацията на псориазис.