Субекти

Резюме

Изследването на хранителната диета и поведението на храненето е основен инструмент за илюстриране на екологичната роля на видовете в екосистемата. Въпреки това, размерът и качеството на пробите за прием на храна затрудняват изследователите да опишат диетичния състав на много малки видове. В нашето проучване ние използвахме геномни инструменти за анализ на диетичния състав на боровата полевка на Savi’s (Microtus savii) с помощта на ДНК баркод и qPCR техники за идентифициране на погълнати растителни видове, извлечени от съдържанието на стомаха. За разлика от предишни проучвания, ние открихме, че въпреки че е изкопаем вид, боровата полевка на Сави е селективна хранилка, която претърпява интензивна повърхностна дейност в търсене на храна. В допълнение, нашето проучване показва, че с a априори познавайки кандидат-растителните видове, включени в диетата на животните, qPCR е мощен инструмент за оценка на присъствието/отсъствието, честотата на поява и елективността на погълнатите видове. Ние заключаваме, че този подход предлага нови възможности за прилагане на анализа на избора на храна при малките животни, като по този начин разкрива подробна картина на взаимодействията между растения и животни.

вариации

Въведение

Изследването на екологията на храненето на животните е от ключово значение за разбирането на тясната мрежа на връзките за хранене между видовете в екологичните общности и на динамиката на енергийния поток в рамките на екосистемите. Веригите от хранителни мрежи илюстрират значението на всеки вид за поддържане целостта на общностите и обясняват как един вид може да повлияе на скоростта на растеж на популациите на други видове 1. Въпреки сдържания си размер на тялото, тревопасните и зърноядните гризачи, които се срещат в голям брой по целия свят, могат значително да променят видовия състав на растителните съобщества, с които се хранят, предизвиквайки важни каскадни ефекти през трофичните нива. Поради тази причина гризачите се считат за ключови видове, способни да оформят структурата и функцията на екосистемите, като подлагат диетата и поведението си на хранене на екологични изследвания 2,3. Анализът на състава на диетата на дребни бозайници обаче смущава изследователите в продължение на десетилетия, защото малките хранителни продукти, открити в съдържанието на стомаха и фекалните проби, са трудни за идентифициране и измерване.

С около 1800 вида гризачите са в центъра на екологичните изследвания 4 поради значителното въздействие, което те оказват върху културите и агроекосистемите по света 5. Въпреки че често се описват като вредители, гризачите също са ключови видове, които допринасят за поддържането на стабилността на екосистемата, като насърчават такива процеси като опрашване и разпръскване на семена 6,7,8, циклиране на въглерод и азот 9,10 и проветряване на почвата чрез ровене и тунелни дейности 10,11 .

Има интуитивен смисъл, че относителното количество хранителни продукти, консумирани от даден вид, се отразява от количеството възстановена ДНК и в крайна сметка от броя на ДНК последователностите, присвоени на всеки елемент. Въпреки това, получаването на количествени данни от последователността на ампликоните не е толкова лесно 26,27,35. Количеството на хлоропластната ДНК може да варира в зависимост от плътността на тъканните клетки, ДНК от различни видове тъкани може да се разгражда диференцирано по време на храносмилането и, разбира се, ефективността на усилване на PCR в крайната точка може да варира значително в зависимост от реакциите. Валидирането на данните за секвениране може да бъде получено чрез създаване на опити за хранене 35,36,37. Алтернативни техники за усилване като количествена PCR в реално време представлява валидна алтернатива на HTS, когато се очакват количествени данни 38,39,40,41,42. Количествената PCR (qPCR) може да предостави набори от данни, подобни на HTS, като същевременно е по-чувствителна, особено към ниски суми на шаблона 43,44 .

Използвахме ДНК баркодиране и qPCR техники за оценка на диетичния състав на подземен вид гризачи и италиански близък ендемизъм, борова полевка на Сави (Microtus savii). Боровата полевка на Сави се среща в пасища, екотонални зони, угарни полета, по брегове и канавки 54. Често се счита за вредител върху земеделските земи и овощните градини поради значителните щети, които може да причини върху култури и овощни дървета 55,56. Въпреки широкото си разпространение, диетата на боровата полевка на Savi’s е слабо разбрана и на практика липсва информация за нейните хранителни предпочитания. Анекдотичните наблюдения показват, че диетата на боровата полевка на Сави се състои предимно от едногодишни и многогодишни тревисти растения, особено Graminaceae, Бобови растения, Chenopodiaceae и Сложноцветни, консумира се на кратко разстояние от изходните отвори на дупката. Избираемост за Розови, които включват няколко икономически важни овощни дървета, все още предстои да бъдат определени.

Нашият подход се основаваше на априорни познания за растителните видове, налични в хранителния диапазон на борови полевки. Растенията бяха взети проби и идентифицирани с помощта на дихотомични ключове. Използвахме rbcL ген като ДНК баркод за идентификация на видовете както за относително по-високата му мощност (напр. 57), така и за относително по-големия брой баркодове, налични в системата за баркод за данни за живота (BOLD) за нашия набор от данни. След това бяха проектирани специфични за видовете анализи на Taqman за qPCR амплификация на ДНК, извлечена от стомаха на полевки. За разлика от крайната точка, полуколичествена PCR, qPCR позволява натрупването на амплифицирани продукти да бъде открито и измерено с напредването на реакцията, по време на експоненциалната фаза на амплификация. Освен оценка на присъствие или отсъствие на растителен вид, номерът на стартовия шаблон може да се определи с точност и висока чувствителност в широк спектър от ДНК проби.

Диетичният състав на борната полевка на Savi’s беше оценен, за да се измери консумацията на растения във връзка с тяхната наличност и да се оценят сезонните вариации в предпочитанията към храната. Доколкото ни е известно, това е първото проучване, което прилага qPCR за количествена оценка на диетата и предпочитанията на видовете на дребен тревопасен бозайник чрез използване на целенасочени анализи като алтернатива на HTS. Освен това задълбоченото разбиране на екологията на хранене на ендемични видове, които са добре адаптирани към променените от човека пейзажи, е от първостепенно значение за определяне на тяхната роля и ефект върху антропо-екосистемите 58 .

Материали и методи

Учебна област

Това проучване е проведено в градина с праскови от 1 ха, разположена в земеделски район в Емилия Романя, Северна Италия (44 ° 21′N, 11 ° 42′E) от ноември 2014 г. до септември 2015 г. Средните годишни валежи са 750 mm и температурите варират между +2.6 ° C и +23.7 ° C. В овощната градина бяха засадени дървета на възраст между 5 и 15 години, разположени на редове на разстояние 4,5 м на разстояние между 1,5 м и 3 м едно от друго. Районът се обработва в съответствие с традиционните практики и периодично се обработва с инсектициди, фунгициди и хербициди. Не са използвани родентициди.

Вземане на проби от растителност

Вземане на проби от полевки

Боровите полевки на Savi’s бяха уловени с помощта на 70 капана за захващане с ябълки, поставени на около 10 см от входа на дупката на полевка. Активните дупки бяха идентифицирани чрез първо търсене на зоните за проучване за входове в дупки. Впоследствие те бяха затворени с пръст. След това дупки бяха посетени след 24 часа и капани, поставени близо до онези входове, които бяха отворени отново от полевки 61. Проведени бяха общо шест сеанса за вземане на проби заедно с вземане на проби от растителност. Всяка сесия за вземане на проби се състои от шест последователни 24-часови събития за улавяне, при които капаните се проверяват на всеки осем часа. Общо 84 полевки (50 мъжки и 34 женски) бяха уловени и взети проби за 144 часа усилие за вземане на проби. Определени са теглото, полът, възрастовата класа и репродуктивният статус. Стомаха са отстранени според Паркинсон и др. 62 и се съхранява при -18 ° C, за да се сведе до минимум разграждането на ДНК.

Идентифициране на ДНК баркод последователност

Търсихме BOLD и Genbank базата данни за последователност за мат К и rcbL генни последователности за всеки от 45-те вида растения, характеризирани по време на нашето проучване, които потенциално са били част от диетата на боровата полевка на Сави. Идентифицирахме 417 bp регион на rcbГен на разположение в Genbank за 40 вида кандидати (допълнителна таблица 1). Частичното rcbL генната последователност е разположена между позиция 455 и 872 на Arabidopsis thaliana справка rcbL пълна генна последователност (присъединяване към GenBank: U91966.1). Специфичните за видовете сегрегиращи места бяха идентифицирани чрез сравняване на последователностите на баркод за 30 растителни вида, докато специфично за рода място за сегрегиране беше характеризирано за пет групи видове, като всяка група се състои от два вида, принадлежащи към един и същи род (допълнителна таблица 2) Сегрегиращите сайтове бяха използвани като целеви позиции за проектиране на 35 уникални анализа на Taqman с помощта на Инструмента за проектиране на персонализиран анализ на Taqman за генна експресия (Thermo Fischer Scientific).

ДНК екстракция

ДНК е извлечена от 30 растителни вида, за които са идентифицирани специфични за видовете места за сегрегация, и от един вид за всяка от петте групи със специфични за рода места за сегрегация. Екстракциите бяха проведени с помощта на протокол, модифициран от Doyle & Dickinson 63 чрез инкубиране на 200 mg хомогенизирана растителна проба в 1 ml лизисен буфер, съдържащ 200 mM Tris-HCl, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 20 mg цетил триметиламониев бромид (CTAB), 0,2 % 2-меркаптоетанол и 10 mg силициев диоксид на прах за 2 h при 65 ° C. Пробите се центрофугират в продължение на 15 минути при 13 000 об/мин. Към супернатантата се добавя един обем хлороформ: изо-амилов алкохол (24: 1). Сместа се центрофугира в продължение на 20 минути при 13 000 об/мин и ДНК се утаява чрез първо инкубиране на супернатантата с 1 обем изопропанол за 30 минути при -80 ° С. След втория кръг на центрофугиране, утайката се промива с 500 μl 70% етанол, центрофугира се в продължение на 15 минути при 13 000 об/мин и се суспендира отново във вода без DNase. ДНК беше точно определена количествено с комплект за анализ на Qubit dsDNA BR във флуорометър Qubit 4.0 и използвана като еталон за количествено определяне на ДНК от съдържанието на стомаха.

След това ДНК се извлича от растения, погълнати от боровата полевка на Savi чрез инкубация на цялото съдържание на стомаха (средно тегло: 443,5 ± 44,8SE mg) в 2 ml микроцентрифужна епруветка с 1 ml лизисен буфер, съдържащ 0,1 mM Tris-HCl, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA и 20 mg CTAB за 3 h при 65 ° C. След това се провежда изолиране на ДНК, както е описано в метода CTAB от Mafra и др. 64. Анализът на цялото съдържание на стомаха гарантира, че всички растителни видове, съдържащи се в стомаха, се вземат проби за екстракция на ДНК.

PCR анализ в реално време, условия и термични профили

Поради разграждането на ДНК в съдържанието на стомаха, дължината на баркодиращите региони, които могат да бъдат успешно амплифицирани чрез PCR, обикновено е ограничена до 100-250 bp фрагменти (вж. 26 и препратките там). В нашето проучване използвахме qPCR в реално време за диетичен анализ чрез проектиране на специфични за вида и рода анализи Taqman. Всеки анализ включва два PCR праймера и специфична за целта олигонуклеотидна сонда, белязана с репортер на флоурецин (FAM) и нефлуоресцентен гасител. Праймерите за напред и назад са проектирани над 200 bp регион, простиращ се 100 bp в посока 3′-5 ′ и 100 bp в посока 5′-3 ′ от целевата площадка, съответно. ДНК сондите на Taqman имат конюгирана част на свързване с малка бразда (MGB), прикрепена към 3 'края. Конюгираният MGB се сгъва в малка бразда, образувана в ДНК, когато терминалът 5–6 bp на сондата се свърже с матрицата. Това осигурява на сондата по-висока температура на топене (тм), близо до тm от праймерите и повишена специфичност за едноосновни несъответствия при повишени температури на хибридизация, като по този начин засилва свързването на сондата. PCR продуктите варират от 59 bp до 102 bp (Таблица 1).

Бяха извършени общо 97 qPCRs за всеки кандидат растителен вид (или род), за да се определи количествено и да се оцени наличието/отсъствието на растителни видове в съдържанието на стомаха на борова полевка на Savi. Реакциите на амплификация включват отрицателна контрола, стандартна серия от разреждания, направена от три повторения на всяко от четирите 10-кратни серийни разреждания на ДНК на кандидат-растителен вид (или род) с известна концентрация, и ДНК проби със специфичен за целта анализ на Taqman. Пробите също включват екзогенен вътрешен положителен контрол (Thermo Fisher Scientific). Вътрешният положителен контрол (IPC) е едноверижен, къс синтетичен ДНК шаблон, който се добавя към всяка амплификационна реакция заедно с двойка специфични праймери и сонда Taqman, маркирана с VIC флуоресцентен репортер. IPC се използва за разграничаване между истински отрицателни резултати и отрицателни резултати, причинени от PCR инхибитори, неправилна настройка на анализа или отказ на реагент или термоциклер.

Стандартна крива

Усилване на четири 10-кратни серийни разреждания на ДНК матрица с известна концентрация беше използвано за генериране на стандартна крива чрез нанасяне на логаризираното начално количество на ДНК матрица (N0) спрямо стойността на праговия цикъл (CT), получена по време на усилването на всяко разреждане. Стойностите на CT на пробите с неизвестна концентрация се сравняват със стандартната крива, за да се изведе количеството на изходната концентрация на ДНК. Бяха извършени три повторения на всяка точка на разреждане в стандартната крива, за да се осигури статистическа значимост.

Ефективността на PCR реакциите в реално време се оценява от коефициента на корелация на Пиърсън и наклона на регресионната линия на стандартната крива. Ако приемем точно аликвотиране и липса на промени в ефективността на амплификацията в диапазона на концентрациите на ДНК (т.е. количеството на PCR продукта се удвоява по време на всеки цикъл на експоненциално амплифициране, водещо до 100% ефективност на реакцията), серията разреждания трябва да доведе до амплификационни криви, които са равномерно разпределени от брой цикли, равни на log2 на фактора на разреждане. С 10-кратно серийно разреждане на ДНК очаквахме CT стойностите на всяко разреждане, разделени от приблизително 3,32 цикъла. Като се има предвид, че наклонът на регресионната линия с уравнение у = aх е промяната в у за единична промяна в х по протежение на линията, тогава промяната в концентрацията на ДНК на една логаритмична единица (10-кратно увеличение) трябва да съответства на намаляване на цикъла от 3.32 и очаквана стойност на наклона от -3.32. Ефективността на усилване (E) се изчислява от наклона на стандартната крива, като се използва уравнението:

извлечена от Rutledge & Côté 65 чрез поставяне на CT върху у-ос и дневник (N0) на х-ос.

Статистически анализ

Средният процент на покритие на всеки растителен вид и гола земя, заедно със свързаната с тях дисперсия, са изчислени чрез усредняване на оценките на Horvitz-Thompson за процентно покритие, получени от 40-те квадрата на изследване на растителността 66. Тъй като се интересувахме само от пропорционалното изобилие от растителни видове, изключихме данните от непокритите почви и пренамерихме данните за растителната покривка между 0–100. Дисперсиите на извадката от скалираните оценки са изчислени с помощта на делта метода (напр. 67).

Количеството растителна ДНК, възстановено от всяко стомашно съдържание чрез qPCR, се използва като прокси за пропорцията на всеки растителен вид, погълнат от отделна полевка. Като прасковата, Prunus persica, е дървесен вид и е известно, че боровата полевка на Savi се храни с корени, а не от въздушни части на растението, не успяхме да оценим наличността му. Следователно не може да се извърши анализ на избора на храна и количеството P. persica ДНК, възстановена в съдържанието на стомаха, не е взета предвид при количествено определяне на дела на погълнатите растителни видове.

Резултати

Таблица 2 показва процентите на очакваната растителна покривка в зоната на изследване, събрани по време на всяка сесия на вземане на проби. Приблизително 50% са многогодишни видове, докато другата половина са едногодишни растения. Диван трева (Elytrigia repens), живовляк ребрист (Plantago lanceolata), широколистен живовляк (Plantago major) и обикновено глухарче (Taraxacum officinale) са били доминиращи видове, които, въпреки сезонните вариации на растителната покривка, представляват по-голямата част от растенията, достъпни за борната полевка на Сави.

Уловихме 20 полевки през ноември, 15 през януари, 10 през март, 15 през май, 13 през юли и 11 през септември. Всяка проба от стомаха съдържа средно 17,5 ± 1,67SE вида растения (диапазон: 8–24). Резултатите от теста за пермутация показват, че делът на растителните видове, открити в стомаха на полевките, не отразява тяхната наличност в района на изследване (P Таблица 3 Процент на полевите полевки на Savi, хранещи се с растителен вид в по-голяма пропорция от очакваната наличност за всяка сесия за улавяне.