• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

Редактирано от Соломон Х. Снайдер, Медицинско училище в Университета Джон Хопкинс, Балтимор, д-р, и одобрено на 23 май 2016 г. (получено за преглед на 10 май 2016 г.)

обръщане

Значимост

Архитектурата на невроналните дендритни дървета е от решаващо значение за мозъчната свързаност, докато дендритните аномалии са свързани с психиатрични разстройства. Редките вариации на броя на копията (CNV) са категория мутации, често свързани с шизофрения, аутизъм и други психични разстройства. Генетичната сложност на CNV разстройствата обаче представлява сериозно предизвикателство за идентифицирането на експериментално достъпни механизми. Тук използвахме мрежов анализ, за ​​да идентифицираме най-важния топологично център в мрежите за взаимодействие между протеин и протеин в рамките на такава CNV и в по-широките генни мрежи на психиатричните CNV. След това показваме, че фармакологичното насочване на този възел обръща дендритни промени в невроналния модел на този CNV, очертавайки стратегия за анализ и обръщане на клетъчни фенотипове при свързани с CNV психични разстройства.

Резюме

Архитектурата на дендритните беседки допринася за невронната свързаност в мозъка. Обратно, аномалии в дендритите са докладвани при множество психични разстройства и се смята, че допринасят за патогенезата. Редките вариации на броя на копията (CNV) са генетични промени, които са свързани с широк спектър от психични разстройства и са силно проникващи. Микродупликацията 16p11.2 е една от CNV, най-силно свързана с шизофрения и аутизъм, обхващаща множество гени, които вероятно участват в синаптичната невротрансмисия. Остават да бъдат идентифицирани съответните за болестта клетъчни фенотипове на микродупликация 16p11.2 и движещият ген (и). Открихме повишена дендритна арборизация в изолирани кортикални пирамидални неврони от миши модел на дублиране 16p11.2 (dp/+). Мрежовият анализ идентифицира MAPK3, който кодира ERK1 MAP киназа, като най-важния топологичен център в мрежите за взаимодействие между протеин и протеин в региона 16p11.2 и по-широки генни мрежи на свързани с шизофрения CNV. Фармакологично насочване на ERK обърнати дендритни промени, свързани с dp/+ неврони, очертавайки стратегия за анализ и обръщане на клетъчни фенотипове при свързани с CNV психични разстройства.

Архитектурата на дендритните беседки определя дендритното поле на пирамидалния неврон (1). Освен това моделите на дендритна арборизация са от съществено значение за изчислителните способности на неврона (1). Следователно генерирането и поддържането на правилни дендритни рецептивни полета е от решаващо значение за функцията на невронната верига, която е в основата на сложното поведение. Обратно, промени в дендритите се появяват при психиатрични разстройства, включително шизофрения и разстройство от аутистичния спектър (ASD) (2).

Психиатричните разстройства имат сложна генетична архитектура, което отчасти се обяснява с редки варианти с висока пенетрантност (3, 4). Въпреки че честотата на тези редки мутации е ниска (4 ⇓ ⇓ –7), натрупаната тежест от редки варианти на риска от заболяване може да представлява значителен дял от случаите при свързани заболявания (8). Най-добре характеризираните форми на редки вариации са големи геномни регионални дублирания или заличавания, известни като вариации на броя на копията (CNV). CNV представляват големи геномни промени, често обхващащи множество гени, които създават значителен риск (коефициент на шансове = 3–30) (9). Повишената рядка натовареност с CNV е свързана с множество психиатрични състояния на невроразвитието, включително шизофрения, ASD и интелектуални увреждания (5, 7, 10, 11). Въпреки това, поради големия брой гени в CNV, разбирането на връзката между генотипа и фенотиповете и рационалното идентифициране на потенциални цели за обръщане на патологично значими фенотипове при нарушения на CNV е предизвикателство.

Тъй като обаче многобройните органи и мозъчните региони са засегнати от CNV (22, 23), е трудно да се разграничат автономните клетъчни видове от системните ефекти. За да се справим с това объркване, тук изследвахме кортикални пирамидални неврони от първични култури от мишки, хетерозиготни за 16p11.2-ортологично дублиране (dp/+) и техните диви тип котила (+/+).

Сложността на генетичната архитектура на психиатричните разстройства представлява сериозно предизвикателство за идентифицирането на експериментално достъпни механизми. Въпреки че определянето на причинно-следствената връзка може да бъде сложно и експериментално трудно достъпно, дори в рамките на една и съща CNV, ние разсъждавахме, че обръщането на фенотипа може да бъде по-достъпно експериментално. Предполага се, че фенотипите на заболяванията са следствие от променени генни пътища или мрежи и оптималните терапевтични цели трябва да бъдат възли, които имат силно влияние върху функцията на цялата мрежа (24). Тъй като използването на мрежови подходи се спекулира, за да може да се помогне да се идентифицират основните двигатели на патогенезата или кандидат терапевтични цели (25), ние допълнително аргументирахме, че използването на мрежов анализ може да осигури подход за намаляване на сложността и идентифициране на явни механизми, които могат да да бъдат впрегнати терапевтично.

Тук използвахме мрежов анализ за идентифициране на потенциални потенциални драйвери за обръщане на фенотипа при dp/+ мишки и последвано от експериментално валидиране на хипотезирания механизъм. Установихме, че dp/+ невроните показват значително повишена дендритна сложност в сравнение с +/+ невроните. Мрежовият анализ идентифицира MAPK3, който кодира ERK1 MAP киназа, като най-важния възел в мрежата на протеин-протеиновото взаимодействие (PPI), свързан със свързани с шизофрения CNV гени, включително 16p11.2. Фармакологичното инхибиране на ERK сигнализирането доведе до обръщане на дендритните промени, което предполага потенциални подходи за лечение.

Резултати

Повишена дендритна арборизация в dp/+ неврони.

Дендритите съставляват рецептивното поле на невроните и промените в дендритната морфология могат да допринесат за аномалии в кортикалната свързаност (26). Следователно ние изследвахме морфологията на дендрит в кортикални пирамидални неврони от мишки, хетерозиготни за ортологично дублиране 16p11.2 (dp/+) и техните диви тип котила (+/+). За да подобрим запазването на междувидовия фенотип и да избегнем объркванията, причинени от ефектите на CNV върху множество органични системи, ние изследвахме дендритите в култивирани първични неврони. На 21–24 d in vitro, ние трансфектирахме култивирани неврони с GFP-експресираща плазмидна ДНК, за да можем да визуализираме клетъчната морфология (фиг. 1 А и Б). Изображенията с една равнина са направени с помощта на 10 × обектив и са проследени и използвани за анализ на Sholl. Установихме, че dp/+ пирамидалните неврони показват значително увеличение на дендритната сложност в сравнение с +/+ невроните [генотип: F (1, 25) = 6,21, P = 0,02; генотип по разстояние: F (49, 1225) = 1,63, P = 0,005] (фиг. 1С).

MAPK3 е централен център в свързани с шизофрения мрежи CNV. (А) Схема на 16p11.2 CNV регион и синонимния регион в мишка хромозома 7. Зелените ленти представляват последователности с повтарящо се копиране, фланкиращи регионите 16p11.2 и 7F4. Доказано е, че редица гени от микродупликационната област 16p11.2 играят подходящи роли в невроразвитието и синаптичните процеси. (B) DCNA. Засенчената област в центъра (съдържаща по-голямата част от гените) се състои от гени, които не са нито значително различни по експресия или свързаност между шизофрения и контролни мрежи; всички 16p11.2 CNV гени са разположени в този сенчест регион. (C) PPI мрежа за гени от пет CNV, свързани с шизофрения. Възлите са цветово скалирани според оценката на централността на централността (CB). (D) Първичната CNV PPI мрежа от C; възлите се мащабират по степен по степен (D) и цветово по CB.

Зависима от дозата повишена експресия на ERK1 и фосфорилиране в dp/+ неврони.

Дендритна арборизация в dl/+ неврони. Анализ на Sholl на общите дендрити в +/+ (n = 14) и dl/+ (n = 10); няма съществен ефект от генотип (P = 0,13) и няма значителен ефект от взаимодействие между генотип и разстояние (P = 0,21). Стойностите са средни стойности ± SEM. Посочени са отделни точки от данни, които са били значими след корекция на Bonferroni: * P1-цистеин (Sigma-Aldrich) при 37 ° C], кортикалните клетки са механично дисоциирани в невронална хранителна среда [Neurobasal + B27 добавка (Thermo Fisher Scientific) + 0.5 mM глутамин (Thermo Fisher Scientific) + пеницилин/стрептомицин (Thermo Fisher Scientific)] и покрити с покритие от поли-d-лизин (Sigma-Aldrich). След 1 h, средата беше заменена с прясна среда, за да се отстранят мъртвите или неприлепналите клетки. Невроналните култури се поддържат при 37 ° С в 5% (обем/обем) СО2. След 4 дни невроналната среда беше допълнена с 200 μM dl -2-амино-5-фосфонопентанова киселина (APV; Abcam Biochemicals) и 100 μM APV добавена среда беше използвана за хранене на всеки 3 d оттук.

Плазмидите (1–10 μg обща ДНК) и Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) се разреждат в DMEM (Corning) и Hepes (10 mM; Corning), смесват се старателно и се инкубират за 20–30 минути при 37 ° C, след което сместа се добавя към култивирани клетки при 21–24 d in vitro в среда без антибиотици. След трансфекцията покривните стъкла бяха заменени в хранителна среда, съдържаща полу-кондиционирана, полу-прясна среда с антибиотици и клетките имаха възможност да експресират конструкции за 3 дни.

Анализ на дендрит.

Западно петно.

Количественото определяне на експресията на общия протеин беше измерено с помощта на Western blot методи, както е описано по-горе (48). Хомогенатите се генерират от отделни покривни стъкла на култивирани неврони +/+ и dp/+ и се анализират за експресия на ERK1, ERK2, pERK1 и pERK2 чрез Western blotting (Фигури 3 A и B и 4A). Фосфорилирането на ERK1 и ERK2 върху остатъците T202 и Y204 отразява тяхното активиране от MEK нагоре по веригата. Експерименти с Western blotting бяха проведени върху 20 проби (11 +/+ и 9 dp/+) от пет отделни култивирани котила. За експерименти с инхибиране на ERK, dp/+ невроните се третират с DMSO (n = 3) или 0.5 μM U0126 (разтворени в DMSO, n = 3) в продължение на 24 часа. За определяне на статистическа значимост на инхибирането е използван еднократен t тест на Mann-Whitney.

Анализ на протеин-протеиново взаимодействие.

Списъци с протеини, кодирани от гени в рамките на пет редки CNV, свързани с шизофрения (1q21.1, NRXN1, 15q13.2, 16p11.2 и 22q11.2) (14), бяха съставени от списъци с гени, адаптирани към номера за присъединяване на протеини, използвайки DAVID ( 50, 51). Списъци с протеини бяха внесени в PINA2 за анализ (31, 52). Протеин-протеиновите взаимодействия бяха качени от PINA2 в Cytoscape (53, 54), за да се визуализира топологията на мрежата. Стойностите на степен (D) и централност (централност между централата, CB; централност на близостта, CC; и централност на степента, CD) бяха извлечени с помощта на интегрирания модул за анализ на мрежата на Cytoscape.

Анализ на мрежата за диференциална свързаност.

SI материали и методи

Анализ на мрежата за диференциална свързаност.

Данните за експресия на човешки дорсолатерален префронтален кортекс са изтеглени от Медицинския изследователски институт на Стенли (https://www.stanleygenomics.org; с любезното съдействие на Tadafumi Kato, Riken Brain Science Institute, Wako, Saitama, Япония). Данните за интензивността на сондата от човешки масиви Affymetrix GeneChip на Human U133A бяха прочетени в R (www.R-project.org) директно от CEL файлове, използвайки пакета affy (55), и обработени съгласно описаните по-рано методи (56). DCNA беше извършена върху експресионните данни, използвайки методите на Fuller et al. (30). Накратко, матриците за съседство бяха конструирани и прочетени в програмната среда на R и анализирани с пакета WGCNA (57). Матриците на съседство бяха нормализирани и трансформирани, за да приличат на претеглена топология на мрежата без мащаб, според Zhang и Horvath (58). След трансформация са генерирани матрици на топологично припокриване (TOM) за всяка субектна група (всички субекти, само субекти на шизофрения и само контролни субекти), които определят мрежовото разстояние за всеки ген.

За да се идентифицират мрежовите модули, TOM бяха преобразувани в матрици за различия. Впоследствие се извърши йерархично клъстериране и идентификация на модули с алгоритъма dynamicTreeCut (59), който се основава на адаптивен процес на декомпозиция и комбиниране на клъстера; процесът беше повторен, докато броят на клъстерите стана стабилен.

Шизофренията и контролните мрежи бяха сравнени чрез изчисляване на диференциални стойности на свързаност DiffKs за всеки ген между шизофренията и контролните условия. DiffK на ген i се дава по формулата D i f f K i = K c o n (i) - K s z, където K (i) = k (i) m a x (k). Тук k (i) представлява мярката за свързаност на ген i, а max (k) означава максималната мрежова свързаност.

Благодарности

Благодарим на П.В. Гейман за концептуални съвети. Тази работа беше подкрепена от NIH Национален институт по психично здраве (NIMH) Grants MH071316 и MH097216 (за PP), MH071616 и MH084803 (за LW и JGC) и R21MH102685 (за JD) и Швейцарска национална научна фондация (SNSF) Early Postdoc Стипендия за мобилност (към MPF).

Бележки под линия

  • ↵ 1 До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: p-penzesnorthwestern.edu .