Обективен Индуцираните от диетата с високо съдържание на мазнини метаболитни нарушения могат да доведат до нарушено производство на сперматозоиди. Целта ни е да проучим дали индуцираната от HFD чревна микробиота дисбиоза може функционално да повлияе на сперматогенезата и подвижността на спермата.

нарушение

Дизайн Фекалните микроби, получени от хранени с HFD или нормална диета (ND) мъжки мишки, са трансплантирани на мишките, поддържани на ND. Анализирани са чревните микроби, броят на сперматозоидите и подвижността. Проби от човешка фекалия/сперма/кръв бяха събрани за оценка на микробиотата, качеството на сперматозоидите и ендотоксина.

Резултати Трансплантацията на HFD чревни микроби в мишки, поддържани с ND (HFD-FMT), доведе до значително намаляване на сперматогенезата и подвижността на сперматозоидите, докато подобна трансплантация с микроби от ND-хранени мишки не успя да го направи. Анализът на микробиотата показва дълбоко увеличение на рода Bacteroides и Prevotella, като и двете вероятно са допринесли за метаболитната ендотоксемия при мишките с HFD-FMT. Интересното е, че чревните микроби от клинични субекти разкриват силна отрицателна корелация между изобилието на Bacteroides-Prevotella и подвижността на сперматозоидите и положителна корелация между кръвния ендотоксин и изобилието на Bacteroides. Трансплантацията с HFD микроби също доведе до чревна инфилтрация на Т-клетки и макрофаги, както и значително увеличаване на провъзпалителните цитокини в епидидима, което предполага, че възпалението на епидидима вероятно е допринесло за увреждането на подвижността на сперматозоидите. РНК-секвенирането разкрива значително намаляване на експресията на тези гени, участващи в мейозата на гамети и митохондриалните функции на тестисите при HFD-FMT мишки.

Заключение Ние разкрихме интимна връзка между индуцирана от HFD дисбиоза на микробиота и дефект в сперматогенезата с повишен ендотоксин, нарушена регулация на експресията на тестисите и локализирано епидидимно възпаление като потенциални причини.

Пробен регистрационен номер NCT03634644.

  • ендотоксин
  • възпаление
  • чревна микробиология
  • диета

Това е статия с отворен достъп, разпространявана в съответствие с лиценза Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0), който позволява на другите да разпространяват, ремиксират, адаптират, надграждат тази работа с нетърговска цел и да лицензират своите производни произведения на различни условия, при условие че оригиналната творба е правилно цитирана, даде се подходящ кредит, всички направени промени са посочени и използването е некомерсиално. Вижте: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.

Статистика от Altmetric.com

Значение на това проучване

Това, което вече е известно по този въпрос?

Диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) води до затлъстяване и метаболитни синдроми и засяга функциите на репродуктивната система.

Съобщава се за индуцирана от HFD чревна микробиота дисбиоза и ендотоксемия.

Възникващите доказателства показват, че дисбиозата на чревната микробиота е тясно свързана с редица основни хронични заболявания, като затлъстяване, диабет, рак, IBD и невродегенеративни заболявания.

Значение на това проучване

Какви са новите открития?

Трансплантацията на фекални микроби, получени от мишки, хранени с HFD, на мъжки мишки, поддържани на нормална диета, доведе до значително намаляване на броя и подвижността на сперматозоидите, което представлява първият доклад за функционалното въздействие на дисбиозата на чревните микроби върху плодовитостта.

След обширен анализ на биоинформатиката, ние показахме, че на ниво род популацията на две Грам-отрицателни бактерии, Bacteroides и Prevotella, беше рязко повишена в червата, трансплантирани с HFD-микроб.

Едновременно с това ендотоксинът в кръвта достигна нивото на ендотоксемия при същите трансплантирани мишки.

Клинично, изобилието от Bacteroides-Prevotella е в отрицателна корелация с подвижността на сперматозоидите на субектите, нивото на ендотоксин в кръвта е положително корелирано с изобилието на Bacteroides в червата.

Установена е силна отрицателна корелация между подвижността на сперматозоидите и високото количество на Prevotella copri (> 15% от общия вид).

Трансплантацията и колонизацията на микробите, получени от мишки, хранени с HFD, причиняват значително увеличаване на чревната инфилтрация на CD3 + Т клетки и макрофаги, както и при епидидимални противовъзпалителни цитокини, което предполага, че ендотоксинът и епидидималното възпаление играят важна роля в индуцираната от дисбиоза на чревните микроби нарушаване на сперматогенезата.

Как може да се отрази на клиничната практика в обозримо бъдеще?

Настоящото проучване представлява първият доклад в областта на чревните микроби, който функционално установява връзката между дисбалансирана чревна микробиота и увреждане на мъжкия фертилитет, както и че някои от тези дисбиози на чревни микроби също са разкрити при пациенти с астенозооспермия.

Представените тук резултати ще хвърлят нова светлина върху причината за мъжкото безплодие и възможността за лечение на поне някои от тези пациенти чрез възстановяване на чревната микробна екосистема.

Въведение

Безплодието е глобален проблем, който засяга до 10% -15% от двойките в много страни с високи доходи и в страни с подобряващи се диетични условия.1 Приблизително половината от безплодието може да се отдаде на мъжете. Трябва да се отбележи, че концентрацията на сперматозоиди е намаляла с над 50% в западните страни от 1973 до 2011 г. и все още няма ефективно лечение, което да забави подобна тенденция.2 Бързият спад на качеството на спермата се дължи по-скоро на факторите на околната среда, а не на генетичните причини, 3 4 като токсин в околната среда, топлина, стрес, 5 тютюнопушене, 6 консумация на алкохол7 и променени хранителни структури. Освен това, с разпространението на затлъстяването, отрицателното въздействие на пренатрупването на мазнини върху репродукцията при мъжете постепенно се признава в клиничните изследвания.8-11 По-специално, скорошно проучване, включващо> 10 000 участници, ясно показа, че качеството на сперматозоидите, включително концентрацията на сперматозоидите, обемът и подвижността, е в отрицателна корелация с увеличения индекс на телесна маса.12 При животински модели, генетично наследена и индуцирана от високомаслена диета (HFD) затлъстяване, нарушена сперматогенеза.13 14 Освен това, HFD може също да доведе до епигенетични смущения на сперматозоидите tsRNAs могат да предизвикат метаболитни нарушения в поколението F1

Както при хората, така и при животните, „западната“ диета с високо съдържание на мазнини и захар може да доведе до затлъстяване и метаболитни нарушения и да прекрои микробната екосистема на червата17 18, съдържаща трилиони микроорганизми.19 Тези микроби в червата на бозайниците модулират много физиологични функции, като като събиране на енергия, 20 поддържане на интегритета на червата, 21 регулиране на имунитета на гостоприемника 22 23 и защита на патогени.24 25 Възмущението на „здравата“ чревна микробиота може да доведе до развитието на различни хронични заболявания, като затлъстяване, 20 26 рак, 22 IBD 27 и диабет.28 Все още обаче не е известно дали HFD може да наруши репродукцията чрез чревната микробиота. Тук разработихме проучване, за да очертаем въздействието на HFD-индуцирана чревна микробна дисбиоза върху производството и подвижността на сперматозоидите.

Материали и методи

Събиране на проби от човешка сперма, плазма и фекалии

Процедури с животни

C57BL/6 мъжки мишки на възраст от 6 седмици са закупени от Моделния център за изследвания на животни от Университета в Нанкин и са поддържани в специфична среда без патогени (SPF) при 12-часов цикъл на светлина и тъмнина с достъп ad libitum до чау и вода. Мишките бяха разделени произволно на групи с нормална диета (ND), HFD, трансплантация на фекална микробиота с нормална диета (ND-FMT) и групи за трансплантация на фекални микробиоти с високо съдържание на мазнини (HFD-FMT) (шест мишки на група, три мишки на клетка). ND групата и HFD групата се хранят съответно с ND или HFD (Research Diet D12451, 45% мазнини). След 4 седмици диетична интервенция, фекалните проби, събрани от ND или HFD мишки, впоследствие бяха трансплантирани в групата ND-FMT или HFD-FMT, които бяха поддържани на ND (вж. „Експеримент за трансплантация на фекална микробиота“). Всички мишки бяха умъртвени след 15 седмици или диетична или FMT интервенция за събиране на серум и тъкани.

Експеримент с трансплантация на фекална микробиота

Двеста mg свежи проби на изпражненията бяха събрани от групата на ND и HFD незабавно при дефекация и ресуспендирани в 4 ml физиологичен разтвор, забъркани за 5 минути и филтрирани от стерилна марля. Трансплантацията на реципиентни мишки е постигната чрез сонда с 200 µL супернатанта от фекалната проба веднъж на всеки 2 дни в продължение на 15 седмици.

Брой сперматозоиди и измерване на подвижността

Епидидимът на кауда се смила в 500 µL фосфатно буфериран физиологичен разтвор (рН 7,2) и се инкубира в продължение на 5 минути при 37 ℃, за да се освободи спермата. Подвижността на сперматозоидите е измерена с оборудване (Хамилтън). Броят на сперматозоидите е количествено определен в хемоцитометър (Marienfeld AP-0650030) под светлинен микроскоп (Leica DM500).

Хистологично изследване

Тестисите или червата бяха отстранени и фиксирани в 4% формалин в продължение на 24 часа, дехидратирани в степенуван етанол, вградени в парафин и разделени (4 µm с дебелина). Срезите бяха оцветени с H&E багрило и наблюдавани под светлинен микроскоп (Leica DM500). Шест микроскопични полета от всяка секция на тестисите бяха избрани на случаен принцип (увеличение от 400 пъти) 30 и бяха преброени различни зародишни клетки (сперматогонии, сперматоцити и кръгли сперматиди) (n = 6/група). Данните са представени като средно ± SEM.

Конфокална микроскопия и имунофлуоресценция

За оцветяване с имунофлуоресценция, парафиновите срезове (с дебелина 4 µm) бяха анализирани с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) като противооцветяване. Основното използвано антитяло е заешко антимише CD3e (1: 400; Abcam). Използваното вторично антитяло (1: 500; Invitrogen) е магарешки антирабит Alexa Fluor488. Секции бяха изследвани под конфокален микроскоп Zeiss LSM800.

Имунохистохимично оцветяване

Парафиновите тъканни участъци (с дебелина 4 µm) се инкубират с антитяло срещу F4/80 (1: 400; технология за клетъчна сигнализация). Специфичните сигнали бяха открити с помощта на EnVision полимерна технология и визуализацията беше извършена с 3,3N-диаминобензидин тетрахидрохлорид. Секциите са заснети с микроскоп LEICA DM2500 с камера LEICA DMC6200.

Измерване на серумните параметри

Миши серумен ендотоксин беше измерен чрез ELISA комплекти (Институт по биоинженерство в Нанкин Джианченг, Китай) в съответствие с протоколите на производителя. Ендотоксинът на човешката плазма е измерен чрез анализ на теста за хромогенни TAL ендотоксини в крайна точка (Bioendo, Китай).

Тест за орален глюкозен толеранс

След 12 часа гладуване всички мишки са били подложени на орален тест за глюкозен толеранс. След орално изследване на D-глюкоза (2 g/kg телесно тегло), кръвни проби се събират от вените на опашката на 0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минути. Нивата на глюкоза се определят с глюкомер (Accu-Chek Performa).

Екстракция на РНК на тестисите и секвениране

Екстракция на фекална геномна ДНК и секвениране

ДНК на фекалиите се извлича от проби от цекума на изпражненията с помощта на QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen 51504) съгласно инструкциите на производителя. Хипервариабилната V3-V4 област на 16S-rDNA гена се амплифицира чрез PCR, като се използват праймерите 341F: CCTACGGGNGGCWGCAG; 806R: GGACTACHVGGGTATCTAAT, където баркодът е осемнадесета базова последователност, уникална за всяка проба. Ампликоните бяха извлечени от 2% агарозни гелове и пречистени с помощта на комплект за екстракция на гел AxyPrep DNA (Axygen Biosciences, САЩ) съгласно инструкциите на производителя и количествено определени с помощта на QuantiFluor-ST (Promega, USA). Пречистените ампликони се обединяват в еквимоларни и сдвоени крайни секвенции (2 × 250) на платформа Illumina, съгласно стандартните протоколи. Суровите показания са депозирани в базата данни на NCBI SRA с номер за присъединяване: SRP168312 за фекални проби от мишки; SRP221703 за човешки проби.

Биоинформатика и статистически анализ на данни за секвениране на 16S-rDNA

За да се получат висококачествени чисти четения, стандартът за избрани валидни четения за анализ беше, както следва: (а) премахване на четения, съдържащи> 10% от неизвестни нуклеотиди (N), (б) премахване на четения, съдържащи 20. Сдвоените крайни чисти четения бяха обединени като сурови тагове, използващи FLSAH (V.1.2.11) с минимално припокриване от 10 bp и процент на грешки при несъответствие от 2%. Шумните последователности на необработени тагове бяха филтрирани по тръбопровод QIIME (V.1.9.1) при специфични условия на филтриране, за да се получат висококачествените чисти маркери. Ефективните маркери бяха групирани в оперативни таксономични единици (OTU) с ≥ 97% сходство, използвайки MOTHUR тръбопровод. Последователността на маркерите с най-голямо изобилие е избрана като репресивна последователност във всеки клъстер. Представителните последователности бяха класифицирани в организми чрез наивен байесов модел, използвайки RDP класификатор (V.2.2), базиран на Greengenes (V.gg_13_5) (http://greengenes.secondgenome.com). Статистиката за изобилието на всяко таксономично и филогенетично дърво е изградена в Perl скрипт и визуализирана с помощта на мащабируема векторна графика. Основният координатен анализ (PCoA) на претеглените унифракови разстояния беше изчислен и нанесен в R.

Статистически анализ

Допълнителен материал

Допълнителен материал

Допълнителен материал

Допълнителен материал

Допълнителен материал

Дисбалансът на индуцирана от HFD чревна микробиота може да предизвика имунен отговор на гостоприемника22 45, който включва хронично възпаление.46 При мишките, трансплантирани с HFD-индуцирани фекални микроби, наблюдаваме силна инфилтрация/агрегация на Т-клетки и макрофаги в ламина проприята на тънките черва, което по извод показвало силно локално възпалително състояние. Дали такова локализирано чревно възпалително състояние е допринесло за наблюдавания сперматогенен дефект, остава да се определи. От друга страна, възпалението на епидидима на caput, отразено от повишената експресия на IL-1β, CXCL-10, MCP-1 и NF-κBp65, може да бъде вероятен виновник за намаления брой сперматозоиди и подвижността в HFD-FMT мишки. Многобройни проучвания демонстрират, че състоянието на възпаление на епидидима влияе негативно върху качеството на сперматозоидите.38 39 47–52 Глобалното повишаване на експресията на NF-κB p65 показва, че оказва противовъзпалително и противовъзпалително въздействие чрез увеличаване на енергийните разходи.53 Въпреки това не видяхме никакви разлика в енергийните разходи между двете третирани с FMT мишки. Това може да се дължи на факта, че повишаването на експресията на NF-κB p65 е ограничено само до определени органи/тъкани като епидидима.

Предишни проучвания са добре установили причинно-следствената връзка между ендотоксемията/възпалението на епидидима и ниската подвижност на сперматозоидите/сперматогенната дисфункция както при животински модели, така и при хора.38 39 47–52 Интраперитонеално приложение на липополизахариди (LPS) може да повиши експресията на провъзпалителни цитокини, като IL-1β, IL-6 и CXCLi2 в епидидима и тестисите на петлите48 и повишават нивото на IL-18 в тестисите на мишки.49 В допълнение, инжектирането на LPS може също да повиши семенната плазма IL-1β, TNF-α, IL -6 нива и водят до ниска подвижност на сперматозоидите при плъхове.50 Важно е, че инкубацията на човешки сперматозоиди с LPS може да доведе до намаляване на подвижността на сперматозоидите.51 Метаболитната ендотоксемия при затлъстяване при хората е силно свързана с нарушена целостта на ДНК на сперматозоидите.52 Тези доклади са в съответствие с нашите хипотеза, че ендотоксемията и епидидимитът, индуцирани от фекална микробна трансплантация, са довели до явните фенотипи в сперматогенезата. По този начин, структурно небалансирана архитектура на чревната микробиота, която се предава от HFD мишки, може да окаже вредно въздействие върху подвижността на сперматозоидите гостоприемници чрез локализирано възпаление на епидидима и системно повишаване на ендотоксина.

Промените в околната среда и „западните“ диети отдавна се смятат за важни фактори, допринасящи за продължителния глобален спад на концентрациите на сперматозоиди при хората. Въпреки че диетата в западен стил може да наруши фертилитета при мъжете отчасти чрез нарушена регулация на възпалението и метаболизма на глюкозата/липидите, това проучване предлага допълнително механистично измерение при свързването на нарушената чревна микробна екосистема с нарушена сперматогенеза и подвижност на сперматозоидите. Поради сложните взаимодействия между гостоприемника и чревната микробиота, трябва да се извърши допълнителна работа за изясняване на механизмите, в основата на въздействието на чревната микробиота върху мъжката репродукция. Представеното тук изследване подчертава възможността за лечение на мъжко безплодие, особено на свързано с метаболитни синдроми, чрез възстановяване на чревната микробна екосистема.