T. Clinkinbeard 1, 2 , R.H. Kline 2 , Л. П. Джанг 2 , S.L. McIlwrath 2 , J.F.Watkins 1 , К.Н. Westlund 2, *

предизвикан

Информация за статия


Идентификатори и Pagination:

История на статията:

лиценз с отворен достъп: Това е статия с отворен достъп, разпространявана при условията на Международния публичен лиценз Creative Commons Attribution 4.0 (CC-BY 4.0), копие от което е достъпно на: (https://creativecommons.org/licenses/ от/4.0/legalcode). Този лиценз позволява неограничено използване, разпространение и възпроизвеждане на какъвто и да е носител, при условие че оригиналният автор и източник са кредитирани.

Резюме

Фон/цели:

Изследването на острия панкреатит при химически индуцирани модели на гризачи даде полезни данни; модели на алкохолен хроничен панкреатит не са налични при мишки. Целта на настоящото проучване беше да се характеризира миши модел на хроничен панкреатит, предизвикан единствено с диета с алкохол и високо съдържание на мазнини (AHF).

Методи:

Мишките са били хранени с течна диета с високо съдържание на мазнини, съдържаща 6% алкохол, както и с добавка с високо съдържание на мазнини (57% от общата хранителна мазнина) за период от пет месеца или като контролен, нормален чау ad ad libitum. Мерките, свързани с болката, използвани като индекс на болка, включват механична чувствителност на задните лапи, определена с помощта на нишки на von Frey и гладка/груба текстурирана плоча. Модифициран тест с плочки допринесе информация за поведенчески реакции от по-висок порядък на висцерална свръхчувствителност. Мишките бяха подложени на механични и термични тестове както с, така и без фармакологично лечение с периферно ограничен агонист на μ-опиоидния рецептор, лоперамид.

Резултати:

Мишките на AHF диета проявяват механична и топлинна свръхчувствителност, както и фиброзна хистология, показателна за хроничен панкреатит. Ниска доза, периферно ограничен опиат лоперамид атенюира както механичната, така и топлинната свръхчувствителност.

Заключение:

Мишките, хранени с алкохол и диета с високо съдържание на мазнини, развиват хистология, съобразена с хроничния панкреатит, както и с чувствителна към опиоиди механична и топлинна свръхчувствителност.

1. ВЪВЕДЕНИЕ

През 2004 г. панкреатитът в САЩ струва приблизително $ 373,3 милиона преки и косвени разходи [1]. Осем на 100 000 души са диагностицирани с хроничен панкреатит в САЩ годишно [2] и до 50% от тези индивиди могат да живеят 20 години след диагнозата [3]. Петдесет от 100 000 души живеят с хроничен панкреатит [4, 5]. Много от тези пациенти търпят силна неразрешима болка.

Развитието на хроничен панкреатит при хората може да бъде резултат от множество възможни допринасящи рискови фактори, един от които е сенсибилизиращият ефект на алкохола върху панкреасните клетки [6]. Активираните с алкохол локални панкреатично реактивни имунни клетки, звездните клетки и тяхното взаимодействие с други видове панкреас и нахлуващи имунни клетки допринасят за свръхпроизводството на извънклетъчни матрични протеини и патогенезата на хроничния панкреатит, който пречи на панкреатичните функции [7 - 10]. Това свръхпродукция се случва, когато звездните клетки на панкреаса се опитват да възстановят увредените панкреатични клетки [11]. Предполага се, че високите нива на алкохол също намаляват разтворимостта на протеините в дукталното пространство, което води до запушване на каналите и последващо саморазграждане на панкреаса [3].

Националната комисия по храносмилателни заболявания (NCDD), под шапката на Националния институт по диабет и храносмилане и бъбречни болести (NIDDK), оценява производството на по-добри животински модели за по-нататъшно изследване на хроничния панкреатит [12, 13]. Понастоящем не съществуват модели на мишки, при които хроничният панкреатит се предизвиква само с комбинация от течна храна с високо съдържание на мазнини с добавка на алкохол и свинска мас. Настоящи модели на гризачи на панкреатит, индуцирани от химически дразнители като церулеин или дибутилтин дихлорид (DBTC), се оказаха плодотворни за проучвания на остър панкреатит [14]. Острите модели обаче не предоставят обхвата на симптомите на хроничен панкреатит, наблюдавани в клиниката, причинени от предразполагащи рискови фактори. По същия начин, хроничният модел е по-подходящ за тестване на терапевтични средства за дългосрочна, изтощителна хронична болка при панкреатит.

В настоящото проучване е описан модел на хроничен панкреатит, предизвикан от алкохол и диета с високо съдържание на мазнини (AHF), базиран на модифицирана диета на Lieber-DeCarli [15], съдържаща 6% етанол, добавено царевично масло и допълнителна свинска мас. Тази диета се използва с голям успех при плъхове за индуциране на хроничен панкреатит в рамките на 4-5 седмици, потвърдено с помощта на хистология на панкреаса и поведенчески проучвания, свързани с болката [16 - 19]. Целта на настоящото проучване беше (1) да се създаде модел на хроничен панкреатит, предизвикан от диета при мишки, хранени с AHF, и (2) да се характеризират произтичащите от болката поведения и панкреатична патология. Хистопатологичното потвърждение на хроничния алкохолен панкреатит включва доказателства за значителна панкреатична фиброза, вакуолизация на мазнини и лоша клетъчна архитектура. Свързаното с болката поведение на механична и топлинна свръхчувствителност се отслабва след антагонизъм с периферно ограничения опиат, лоперамид, в модела на миши хроничен панкреатит.

2. МЕТОДИ

Проучванията са извършени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от Националния здравен институт. Всички процедури бяха одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Университета в Кентъки.

2.1. Индукция на панкреатит

За това проучване бяха използвани петмесечни мъжки мишки на фон C57BL/6 с тегло под 40 g (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). Животните бяха настанени при 21-24 ° C, при обратна светлина: тъмно 14:10 часов график. Контролните мишки бяха хранени с гризач, съдържащ 10,4% мазнини (Mouse Breeder Diet 8626, Teklad, Madison, WI, USA). Мишките с AHF панкреатит са хранени с течна диета (LD101A, Test Diet, Richmond, IN, USA) с добавено царевично масло (3.3%, 33/1000 g) и допълнителна свинска мас, давана ежедневно в подправка (1 g). Общото съдържание на мазнини беше

57%. Алкохолът в течната диета се увеличава ежеседмично от нула на 4%, 5% и след това 6%. Хранените с AHF мишки бяха поддържани с 6% алкохол през останалата част от проучването. Телесното тегло се проследява седмично.

2.2. Оценка на поведението, свързано с болката

2.2.1. Изпитване на праг за изтегляне на лапата

Мишките бяха поставени върху повдигната тефлонова маса с телено дъно в кабини от плексиглас (7 х 4 х 4 см) и се аклиматизираха за 30 минути. Von Frey нишки ((4.74) 6.0g; (4.31) 2.0g; (4.08) 1.0g; (3.61) 0.4g; (3.22) 0.16g; (2.83) 0.07g; (2.36) 0.02g; (1.65) 0.008 ж)) се прилагат върху плантарната повърхност на задните лапи, както е описано по-рано, за да се определи механичният праг на отнемане [17 - 20]. Намаленият праг на отнемане на лапата е показател за механична свръхчувствителност.

2.2.2. Гладка или груба механична плоча

Тестовият апарат се състои от прозрачна кутия от плексиглас (11 х 8 х 8 см) с гладък под или подова настилка с груба текстура. Грубата вложка представлява текстурираната страна на дифузьор на панел за таван от полистирол (Cat. # 89091, Lowes, Mooresville, NC, USA). Отглеждането на изследователска дейност, включително честота и продължителност, се наблюдава в реално време и се улавя с помощта на персонализиран софтуер по време на тестове от 5 минути.

2.2.3. Модифициран анализ на котлона с температура 44 ° C

Мишките бяха поставени на котлон с температура 38 ° С за 10 минути, за да загреят бавно краката на животните. След това животните бяха поставени върху котлон с температура 44 ° С за 10 минути период на изпитване [21]. Броят на скокове, събития за отглеждане и латентност за първи скок бяха записани с помощта на персонализиран софтуер.

2.3. Тествайте лекарства

2.3.1. Муго-опиоиден рецепторен агонист

Лоперамид (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA) се суспендира в 20% разтвор на 2-хидроксипропил-β-циклодекстрин (Sigma-Aldrich) във физиологичен разтвор и се разрежда до правилната концентрация на дозата. Инжекциите на лоперамид се правят интраперитонеално (i.p.) при 0,4, 0,6, 0,8 или 1,2 mg/kg. Поведенческите анализи започнаха 60 минути след инжектирането [1, 22].

2.4. Хистология

Мишките бяха перфузирани транскардиално с 4% параформалдехид (PFA) и панкреатите бяха изрязани и пост-фиксирани за една нощ, след това променени на 70% етанол. Тъканите на панкреаса бяха вградени в парафин, разрязани (10 μm) с помощта на моторизиран микротом (Microm 350; Хайделберг, Германия) и монтирани върху стъклени пързалки.

2.4.1. Сириус Червено оцветяване за колаген

Панкреатичните срезове бяха депарафинизирани, рехидратирани и оцветени със Sirius Red (0,1%; Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) и Fast Green counterstain. Използван е микроскоп Nikon Eclipse E1000 с 20-кратна цел за заснемане на произволни изображения от пет секции на животно с помощта на софтуера ACT-1. Използвана е компютърно-асистирана денситометрия (NIH ImageJ) за изчисляване на процента площ на фиброзна тъкан, оцветена в червено от Sirius Red.

2.4.2. Оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E)

Депарафинизираните стъкла се изплакват с чешмяна вода и се оцветяват за 1 мин с 0,1% хематоксилин (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). Слайдовете се измиват, дехидратират и се оцветяват в продължение на 1 минута с 0,1% еозин, преди да се подхлъзне покритието с Permount (Fisher Scientific).

Фотомикрографиите на панкреаса за всяко животно бяха взети от 5 произволно избрани секции и анализирани за морфологични промени.

2.5. Статистически анализ

Данните са представени като средни стойности ± S.E.M. Сравненията между групите в различни моменти от време или различни дози бяха извършени с двупосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от множество сравнения на Tukey след тестове, използвайки SigmaPlot версия 12.0 (Systat Software, Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Използват се двустранни t-тестове, където е подходящо. P≤0.05 се счита за значимо.

3. РЕЗУЛТАТИ

3.1. Хроничните AHF Fed мишки са имали повишена фиброза и хистология в съответствие с хроничния панкреатит

Хистологията на панкреаса на мишки, хранени с AHF, показва морфологично нарушение, характерно за хроничния панкреатит: клетъчна атрофия, адипоцити и увеличени интралобуларни пространства (Фиг. 1В , ° С , Е. ), в сравнение с панкреатичните тъкани от контролни мишки (Фиг. 1А , д ). Мастните инфилтрации на липидни вакуоли бяха видими в панкреатичната тъкан на мишки, хранени с AHF. И двете групи са имали тумороподобни структури (Фиг. 1С ).

Значително увеличена площ на фиброза в червено със Sirius е идентифицирана в проби от тъкан на панкреаса от мишки, хранени с AHF, в сравнение с контролите (Фиг. 1F ) (контрол: 5,5 ± 1,2%, AHF: 21,0 ± 2,7%; стр

3.2. Животните, хронично хранени с AHF диета, развиха механична свръхчувствителност

Вторичната механична свръхчувствителност беше оценена чрез определяне на спонтанно поведение при бягство (събития при отглеждане и продължителност на отглеждане) на гладка или грапава повърхност, както и чрез тестване на праговете за оттегляне на задната лапа (Фиг. 2 ). На грапава повърхност хранените с диета AHF животни показват значително по-голямо поведение при отглеждане (AHF [n = 6]: 38,8 ± 3,5; контроли [n = 7]: 26,0 ± 4,2; p 2A , Б. ). Не са наблюдавани разлики в спонтанното поведение при бягство, когато животните са били тествани на гладка повърхност (събития при отглеждане: AHF: 31,8 ± 4,2; контроли: 24,5 ± 5,5; продължителност на отглеждане: AHF: 33,0 ± 5,4 s; контроли: 23,5 ± 5,6 s). По същия начин праговете за механично изтегляне на задните лапи на мишки, хранени с AHF, бяха значително намалени (0,49 ± 0,16 g) в сравнение с тези на контролите при тестване на влакна на von Frey (1,33 ± 0,23 g; p 2C ).

3.2.1. Лоперамид с еднократна доза атенюирана-механична свръхчувствителност

Лоперамид е периферно ограничен му-опиоиден агонист, който обикновено се използва като антидиарейно средство. Животните, хранени с AHF диета, получават системно лоперамид (0,6 mg/kg, i.p.) и се определят праговете за отнемане на лапата (Фиг. 2D ). Механичната свръхчувствителност беше значително обърната на 1 h (AHF + Loperamide [n = 6]: 0.93 ± 0.33 g; AHF + VEH [n = 4] 0.24 ± 0.10 g) и 2 h (AHF + Loperamide: 1.10 ± 0.35 g; AHF + VEH 0,15 ± 0,10 g) времеви точки след инжектиране, връщане към нивата преди инжектиране с 3 часа.

3.3. AHF Fed мишки развиха свръхчувствителност към топлина

В модифицирания тестов плот животните се поставят върху аналгезиометъра и се записва броят на отглежданите събития по време на 5-минутен период на изпитване, за да се определи чувствителността към топлина. Използвайки модифицирания тест за котлони при 44 ° C, мишки, хранени с AHF, отглеждат значително повече от контролните животни (AHF: 59,8 ± 7,5; контрол: 32,8 ± 1,4; p 3A ). При 38 ° C не се открива разлика между двете групи; мишки, хранени с AHF, отглеждат 23,0 ± 6,7, а контролните животни отглеждат 19,8 ± 8,0 пъти.

3.3.1. Зависими от дозата лоперамид атенюирани ноцифанзивни отговори в теста с 44 ° C модифициран котлон

Мишките, хранени с AHF диета, бяха лекувани с единична ниска доза лоперамид (i.p.) и топлинната чувствителност беше измерена 1 час по-късно с помощта на модифицираната 44 ° C плоча (Фиг. 3В ). Системният лоперамид намалява събитията на отглеждане в зависимост от дозата (0,4 mg/kg: 36,5 ± 4,9; 0,8 mg/kg: 31,3 ± 4,3 събития; 1,2 mg/kg: 27,7 ± 5,3). Само най-високата концентрация на лоперамид успя да намали значително броя на събитията по отглеждане (стр

4. ДИСКУСИЯ

Настоящото проучване демонстрира неинвазивен, индуциран от алкохол и диета с високо съдържание на мазнини модел на мишка на хроничен панкреатит, който е получен при мишки от див тип в отсъствието на вредни химикали. Моделът на AHF диета демонстрира хистология и свързано с болката поведение, близко наподобяващо клинични симптоми на хроничен панкреатит, както напоследък призоваха NCDD и NIDDK [12]. В клиниката се съобщава, че до 70% от пациентите с хроничен панкреатит злоупотребяват с алкохол и рискът от панкреатит се удвоява при лица с наднормено тегло и затлъстяване [11, 23]. Моделът на AHF мишка използва диета, която съдържа алкохол, комбиниран с високо съдържание на мазнини, като по този начин предизвиква „двоен удар“ в метаболизма на животното. Това нарушава хомеостазата, което води до хронично възпаление на панкреаса и поведение, свързано с болката.

Хистологичният анализ на секциите на панкреаса установява, че само AHF диетата предизвиква фиброза, лоша клетъчна архитектура и образуване на вакуола на мазнини, подобно на предишните ни проучвания с плъхове [17 - 19, 24]. Количеството фиброзна тъкан в участъци на панкреаса от мишки, хранени с AHF, се увеличава значително в сравнение с пробите от див тип, съобразени с възрастта. Повишената фиброза е често срещана характеристика при хроничен панкреатит, причинен от свръхактивиране на звездни клетки на панкреаса (PSC), локални имунни клетки в панкреаса [7]. В присъствието на алкохолни метаболити и излишни мастни киселини, обикновено се активират PSC в покой [24]. Постоянното свръхактивиране на PSCs причинява прекомерно производство на колаген, което води до широко разпространена панкреатична фиброза и характерни увреждания, наблюдавани при хроничен панкреатит. Повишената фиброзна панкреасна тъкан при мишки, хранени с AHF, се интерпретира като индикатор за хронично свръхактивирани PSC в нашия модел на мишка.

Поведенческата механична и топлинна свръхчувствителност беше определена при AHF мишки, хранени след 7 седмици и продължи до края на експеримента. Животните, хранени с AHF, показват значително повишено поведение при бягство от груба тествана повърхност и намалени прагове за отнемане на лапата в сравнение с контролите. В същото време животните, хранени с AHF, са по-чувствителни на топлина, опитвайки се да избягат от модифицираната с 44 ° C плоча по-често от контролните мишки. Алкохолът и метаболитните продукти на мастните киселини активират не само PSC, но и директно сенсибилизират ноцицепторите, инервиращи панкреаса, като по този начин произвеждат поведение, свързано с болката. По-специално каналите на преходен рецепторен потенциал (TRP), които се експресират върху PSC, както и сензорни неврони, са идентифицирани като преобразуватели на тези метаболити [19, 24 - 27].

Хроничната болка е значителен проблем за пациентите и този, който е най-важният за справяне. Лабораторното тестване на аналгетици върху животни традиционно се ограничава до тестване при модели на остра болка. Настоящото проучване демонстрира модел с реакции, свързани с болката, продължаващи поне до 10 седмици на изследване, подходящ за тестване на рефлексивни реакции със стимули като тестовете на влакната на фон Фрей и котлона. Този модел осигурява стабилен фон за тестване на ефикасността на терапевтичните средства в продължение на много седмици. Второ ограничение на предишни проучвания върху животни при остри модели е, че лекарствата, които са били тествани в лабораторни опити с животни, не винаги се оказват ефективни при лечението на клинична болка. Постоянните реакции, свързани с болката, в модела на AHF панкреатит са по-сравними с хроничната клинична болка при пациенти с хроничен панкреатит. Идентифицирането на нови неапиатни аналгетици за ефективно намаляване на сигнализирането за висцерална болка е критична неудовлетворена клинична нужда за този синдром с изтощителна болка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диетата AHF е подходяща за индуциране на модел на хроничен панкреатит при мишки от див тип при липса на вредни химикали. Наблюдаваната хистопатология и поведенческа свръхчувствителност в нашия модел са подобни на клиничните доклади. Това показва, че AHF моделът на мишка е подходящ за изследване на механизми на хронично възпаление на панкреаса и за идентифициране на нови фармакологични интервенции в хронични моменти от време.

ОДОБРЕНИЕ НА ЕТИКАТА И СЪГЛАСИЕ ЗА УЧАСТИЕ

Всички процедури бяха одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Университета в Кентъки.