Отделение по патология и молекулярна медицина, Център за имунология на McMaster и Институт за изследване на инфекциозни заболявания, Университет McMaster, Хамилтън, Онтарио, Канада

интерлевкин-15

Отделение по патология и молекулярна медицина, Център за имунология на McMaster и Институт за изследване на инфекциозни заболявания, Университет McMaster, Хамилтън, Онтарио, Канада

Отделение по патология и молекулярна медицина, Център за имунология на McMaster и Институт за изследване на инфекциозни заболявания, Университет McMaster, Хамилтън, Онтарио, Канада

Отделение по патология и молекулярна медицина, Център за имунология на McMaster и Институт за изследване на инфекциозни заболявания, Университет McMaster, Хамилтън, Онтарио, Канада

  • Никол Г. Бара,
  • Мариан В. Дъвчете,
  • Сара Рийд,
  • Али А. Ашкар

Фигури

Резюме

Цитат: Barra NG, Chew MV, Reid S, Ashkar AA (2012) Лечението с интерлевкин-15 предизвиква загуба на тегло, независимо от лимфоцитите. PLoS ONE 7 (6): e39553. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039553

Редактор: Jianping Ye, Център за биомедицински изследвания в Пенингтън, Съединени американски щати

Получено: 1 март 2012 г .; Прието: 26 май 2012 г .; Публикувано: 29 юни 2012 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена с безвъзмездни средства от канадските институти за здравни изследвания. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Затлъстяването се определя като натрупване на мастна тъкан и е свързано със системно хронично възпаление [1]. Променените имунни отговори при лица със затлъстяване наскоро са свързани с развитието на съпътстващи заболявания като инсулинова резистентност и дислипидемия [1] - [3]. Като възпалително състояние затлъстяването се характеризира с повишена инфилтрация на различни имунни клетки в мастната тъкан, като M1 поляризирани макрофаги, както и намаляване на противовъзпалителните имунни клетки като M2 поляризирани макрофаги [2], [4]. Тъй като честотата на разпространение и свързаните с него хронични заболявания продължават да нарастват, прозренията за патофизиологията, свързана със затлъстяването и имунния принос за развитието на метаболитни заболявания са от съществено значение при формулирането на нови терапевтични стратегии за лечение на затлъстяването и свързаните с него съпътстващи заболявания.

Въпреки че няколко доклада са изследвали ролята на променените фенотипи на мастните макрофаги при индивиди със затлъстяване [2], [4], [5], неотдавнашни проучвания също демонстрират връзки между затлъстяването и промените в популациите на лимфоцитите. В затлъстелата мастна тъкан са установени увеличени CD8 + Т клетки и намалени CD4 + и противовъзпалителни регулаторни Т клетки [6], [7]. Доказано е, че затлъстелата мастна тъкан активира CD8 + Т клетки, което води до набиране и активиране на макрофаги [7]. Освен това е показано, че естествените клетки убийци Т (NKT) играят роля в метаболитни аномалии, свързани със затлъстяването [8], [9]. И накрая, вродените имунни клетки с естествени убийци (NK) намаляват цитотоксичността при затлъстели животни в сравнение с постните контроли [10]. Промените в тези лимфоцитни популации при индивиди със затлъстяване предполагат, че наличието или отсъствието на тези клетъчни типове може да играе роля в регулирането на теглото. Тъй като дисрегулацията в производството на възпалителни цитокини също допринася за това възпалително състояние чрез фактори като интерлевкин-6 (IL-6) и фактор на туморна некроза –α (TNF-α) [11], определяйки ролята на тези цитокини в регулирането Имунните лимфоцитни отговори при затлъстяване също са от съществено значение при формулирането на лечения за затлъстели индивиди.

В това проучване ние се опитахме да определим дали NK клетките медиират загуба на тегло при третирани с IL-15 животни. Първо определихме дали NK клетките, заедно с други лимфоцити като NKT и Т клетки, се натрупват в мастната тъкан с остра IL-15 обработка при контролни мишки B6. За да определим дали IL-15 индуцира загуба на тегло индиректно чрез NK клетъчно активиране, ние изчерпахме мишки от NK клетки, използвайки NK1.1 изчерпващо клетките антитяло, лекувано с IL-15 и наблюдавано за загуба на тегло. За да се определи значението на активирането на лимфоцитите чрез лечение с IL-15, ние използвахме и модела RAG2 -/- γc -/- мишка, който няма лимфоцити и липсва γ-рецепторна субединица. Като цяло тези експерименти ще определят ролята на лимфоцитите, по-специално NK клетките, в регулирането на IL-15 на мастната тъкан.

Методи

Етика

Всички експерименти с животни са одобрени от Етичния съвет за изследване на животните (AREB) на университета Макмастър. Номерът за одобрение на AREB е: 10-02-12.

Животни

Шестнадесет седмични женски мишки C57BL/6 (B6) са закупени от лабораторията Charles River (Квебек, Канада). Мишки с дефицит на женски лимфоцити Balb/c RAG-2 -/- γc -/- бяха отгледани от разплодни двойки, дадени като подарък от M. Ito (Централен институт за опитни животни, Kawasaki, Япония) и поддържани в Централния център за животни на Университета Макмастър. Нулевата мутация на гена RAG2 предотвратява развитието на В и Т лимфоцити при тези мишки, докато липсата на субединицата на γ-веригата предотвратява узряването на NK клетките. Мишките бяха затворени в групи от по петима и държани при контролирано осветление (12∶12 L: D) и температура (22 ° C) с либитум достъп до облъчена диета с ниско съдържание на мазнини, съдържаща 18,6% протеин, 6,2% мазнини и 3,5% фибри (2918, Tekland Global Diets, Indianapolis, IN) и вода.

Доставка и откриване на експеримент за изчерпване на клетки IL-15 и NK1.1 +

Теглото на тялото и консумацията на храна се проследяват ежедневно от началото на лечението до умъртвяването на мишки. Консумацията на храна се измерва за период от пет последователни дни. Претеглената храна се поставя в бункери за храна и се измерва ежедневно на база клетка. Приемът на храна се записва като консумирани грамове на грам мишка на ден. Процентът на загуба на тегло е регистриран, когато на мишките е доставен Ad-експресиращ човешки IL-15 вектор, Opt.hIL-15 (“AdIL-15”), или празен аденовирусен вектор (“AdControl”), както е описано по-горе [28] . Накратко, 18-аа оптимизиран сигнален пептид беше вмъкнат нагоре по течението на зрял hIL-15 ген чрез многостепенни полимеразни верижни реакции (PCR), използвайки праймери, предоставени от Института за молекулярна биология (Университет Макмастър). След като 402-bp PCR продуктът беше изолиран (Opt.hIL-15), клониран в експресионни вектори, използвайки KpmI и XhoI места, Opt-hIL-15 беше вмъкнат в аденовирусния вектор на совалката pDC316 и впоследствие генериран Ad-Op-hIL-15 pDC316 в лабораторията Robert E. Fitzhenry Vector Laboratory (Център за имунология на McMaster, Университет McMaster) [28].

B6 мишки и RAG-2 -/- γc -/- мишки бяха администрирани с 5 × 10 8 pfu AdIL-15, AdControl или 200 µl PBS чрез IV инжекции с опашка на ден 0, 2 и 4 (n = 5 на група ). За експеримента с изчерпване на NK1.1 +, B6 мишките се инжектират интраперитонеално с 200 ug антимиши NK1.1 антитела (PK136 миши имуноглобулин G2a хибридом HB191; ATCC) дневно в продължение на два дни преди лечение с AdIL-15 и впоследствие на всеки три дни след лечението (n = 7 на група). Мишките се анестезират и се жертват на ден 8. Преди да се умъртви, кръвта се събира през коремната аорта и се центрофугира при 5000 об/мин за 10 минути, за да се събере серум. Нивата на човешки IL-15 се определят количествено от серума с помощта на hIL-15 DuoSet ELISA комплект (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Събиране на мастна тъкан, хистология и количествено определяне

Подложки от висцерални гонадни мазнини от RAG-2 -/- γc -/- мишки бяха претеглени и фиксирани в параформалдехид. След това тъканите бяха вградени в парафин и две напречни сечения на мишка бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E). За всяко напречно сечение бяха изчислени количествено 8 зрителни полета за клетъчни области с помощта на софтуера AxioVision (създаден от Carl Zeiss MicroImaging).

Изолация на клетки от мастна тъкан за анализ на FACS

Претеглените висцерални подложки на мастните жлези от мишки B6 бяха изолирани, измити в PBS, смлени и усвоени в колагеназа А (Roche Applied Science, Laval, Квебек, Канада) и 0,025 mg/ml DNase (Roche Applied Science, Laval, Квебек, Канада) за 30 минути при 37 ° С. Клетъчната суспензия се филтрира през 100 цт, последвано от 70 цт и 40 цт клетъчна цедка за отстраняване на частици от тъканите. След това този разтвор се центрофугира за 10 минути при 1200 об/мин при 4 ° С. Супернатантът, който включва всички останали адипоцити, се изхвърля и стромалната съдова фракция се ресуспендира в ACK лизисен буфер за отстраняване на червените кръвни клетки и се промива в PBS. Клетките бяха преброени с помощта на хемоцитометър и ресуспендирани в 0.2% разтвор на PBS разтвор на говежди серумен албумин за FACS анализ. Петстотин хиляди клетки на гнездо се посяват в плоча с 96 гнезда. След като клетките бяха измити и блокирани с помощта на CD16/CD32 антитяло (eBioscience, Сан Диего, Калифорния), те бяха изплувани на повърхност, оцветени с флуоресцеин изотиоцианат–, алекса флуор 700- и конюгиран с микоеритрин анти-мишка CD45.2 (клон 104, eBioscience), CD3 (клон 17A2, eBioscience) и NK1.1 (клон PK136, BD Pharmingen), съответно антитела. Оцветените клетки бяха анализирани на поточен цитометър LSRII, събиращ 50 000 затворени събития и софтуер за анализ на поточна цитометрия FlowJo.

Статистика

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на Graph Pad Prism 4. Резултатите са изразени като средно ± SEM. Данните бяха анализирани с помощта на еднопосочен ANOVA, последван от тест за множество сравнения на Tukey за 3 групови сравнения, докато Student-t-тест беше използван за 2 групови сравнения. Значимостта е посочена, когато p Таблица 1. Характеристики на мишки преди и след третиране с IL-15.

(A) Стълбовата диаграма показва процент на загуба на тегло при женски мишки B6, третирани i.v. или с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), празна аденовирусна конструкция, която не експресира IL-15 (Ad-Control), или IL-15, експресираща аденовирусна конструкция (AdIL-15). (Б.) Серумът, събран на 8-ми ден, се анализира за експресия на IL-15, използвайки комплект hIL-15 DuoSet ELISA. (° С) Посочените клетки са броят на клетките в стромалната съдова фракция от усвоената мастна тъкан във всяка група. Оста y се отнася до броя на клетките (× 10 6), отчетени от стромалната съдова фракция на грам усвоена висцерална мастна тъкан на гонадите, показана в стълбовидна диаграма (n = 5 на група). ** P +), T (CD3 +), NK (CD3 - NK1.1 +) и NKT (CD3 + NK1.1 +) клетки във висцералната мастна тъкан в сравнение с контролите (Фигура 2). По подобен начин периферните левкоцити, Т, NK и NKT клетките също са значително повишени в далаците на третирани с IL-15 мишки в сравнение с контролите (данните не са показани).

Анализ на (A) CD45 +, (° С) CD3 + (T), (Е.) CD3 - NK1.1 + (NK) и (G) CD3 + NK1.1 + (NKT) клетъчни популации във висцерална гонадна мастна тъкан от третирани с PBS, AdControl и AdIL-15 животни. Процентът от (Б.) CD45 +, (д) CD3 + (T), (F) CD3 - NK1.1 + (NK) и (З.) CD3 + NK1.1 + (NKT) клетъчни популации са представени като стълбовидни графики (n = 5 на група). *** P + клетъчно изчерпващо антитяло е ефективно при изчерпване на NK и NKT клетки от мастна тъкан (Фигура 3А, В) Не открихме значителна разлика в процента на загуба на тегло при мишки B6, третирани с AdIL-15, в сравнение с тези, изчерпани от NK и NKT клетки (Фигура 3C, Таблица 2).

Анализ на CD3 и NK1.1 клетки, затворени от CD45.2 + популация в (A) Третирани с AdIL-15 мишки B6 и (Б.) NK1.1 + изчерпани AdIL-15 третирани мишки във висцерална мастна тъкан на гонадите. (° С) Стълбовата графика показва загуба на тегло при третирани от жени мишки (n = 7 на група).

Лечението с Интерлевкин-15 предизвиква отслабване при липса на лимфоцити

Тъй като лечението с остро IL-15 доведе до натрупване на други лимфоцитни клетки като Т-клетки, ние използвахме мишки с дефицит на лимфоцити RAG2 -/- γc -/-. Тези мишки са имали сходно телесно тегло между групите преди лечението (Таблица 1). Мишките, третирани с AdIL-15, са загубили значително повече тегло в сравнение с животните, третирани с AdControl или PBS (Фигура 4А). Третирането на тези мишки с AdIL-15 ясно показа значителна разлика в размера и теглото на коремната висцерална мастна подложка на мастната жлеза в сравнение с наивните и контролните носители (Фигура 4В, С). Тези разлики не се дължат на променена консумация на храна (Фигура 4D).

(A) Процент на загуба на тегло, представен като стълбовидна диаграма. (Б.) Снимката показва изрязана висцерална мастна жлеза, взета от представителни женски наивни, Ad-Control и AdIL-15 третирани RAG2 -/- γc -/- мишки. (° С) Висцерална мастна подложка в грамове, показана като стълбовидна диаграма (n = 5 за група). (д) Консумирана храна на грам мишка, наблюдавана в продължение на 5 последователни дни (n = 5 на група). * P -/- γc -/- мишки в сравнение с Ad-Control и PBS групите (Фигура 5). Това предполага, че ефектите на IL-15 върху затлъстяването не се медиират от лимфоцитите и се проявяват независимо от сигнализирането през общата γ-верига.

Проучванията in vitro показват, че IL-15 влияе директно върху мастната тъкан, използвайки култивирани адипоцити. Доказано е, че лечението с рекомбинантно IL-15 инхибира преадипоцитната диференциация и отлагането на липиди, използвайки мишата адипогенна клетъчна линия 3T3-L1 [37]. Подобни резултати бяха показани при получени от липоаспират човешки адипоцити, третирани с IL-15 по време на диференциация [14]. Инхибирането на диференциацията на преадипоцитите е свързано с повишена експресия на иРНК на калциневрин [38] и/или промени в експресията на сигнални преобразуватели и активатор на транскрипция 5 (STAT5) [39]. Също така наскоро беше показано, че приложението на IL-15 влияе върху съдържанието на липиди в зрели диференцирани адипоцити in vitro, което предполага, че IL-15 директно влияе върху адипоцитите, независими от лимфоцитите [39].

По-рано беше показано, използвайки анализи за защита на рибонуклеаза, че иРНК и за трите сигнални субединици на рецептора на IL-15 (α, β, γ) присъстват в бялата мастна тъкан, което предполага, че циркулиращият IL-15 е способен да сигнализира директно в адипоцитите [ 18]. IL-15 сигнализира чрез хетеротримерен рецепторен комплекс, включително β субединица, споделена с IL-2 и γ-верижна субединица, споделена с други интерлевкини (IL-2, -4, -7, -9 и -21). Третата уникална α субединица придава специфичност и свързване с висок афинитет на IL-15 с този комплекс [40], [41]. Проучванията показват, че IL-15 сигнализира по различен начин в имунните лимфоцити в сравнение с милейодните популации [42,43, Преглед на 41]. Понастоящем не е известен механизмът на сигнализиране на IL-15 в адипоцитите.

Дефицитният на лимфоцити RAG2 -/- γc -/- модел на мишка няма зрели NK клетки поради липсата на рецепторната γ-верижна субединица, която е необходима за узряването на NK клетки. Важността на сигнализирането през γ-веригата на рецептора е изследвана по-рано при други модели на животни. Alvarez et al. показва лечение с IL-15, намалява масата на бялата мастна тъкан, без да променя приема на храна при мишки с дефицит на лептин ob/ob, но не и при плъхове Zucker с отрицателен рецептор за лептин. Тези автори установяват, че IL-15 не влияе на мастната тъкан при тези затлъстели плъхове поради регулиране надолу в рецепторната експресия на у-веригата [18]. Нашите данни в RAG2 -/- γc -/- мишки, от друга страна, показват, че рецепторната γ-верига не е необходима за IL-15, за да предизвика загуба на тегло и да намали размера на адипоцитните клетки. Това предполага, че субъединицата на γ-веригата е необходима за сигнализиране на IL-15 в адипоцитите или в негово отсъствие могат да възникнат компенсаторни механизми. Въпреки че е доказано, че рецепторната γ-верига е необходима за развитието на NK и NKT клетките [32], [44], по-рано сме показали, че IL-15 може да медиира ефектите си в отсъствието на тази рецепторна субединица, което води до антитуморна и антивирусна активност [28], [45], както и при активиране на миелоидни имунни клетки [46].

В заключение, нашите данни показват, че лечението с IL-15 води до натрупване на NK, NKT и CD3 T лимфоцити в мастната тъкан. Въпреки това, IL-15 медиира загубата на тегло, независимо от активирането и сигнализирането на лимфоцитите чрез общата γ-верига. В момента липсват знания относно ефектите на IL-15 върху метаболитните тъкани. Нашите открития имат ясни последици в областта на имунния метаболизъм, като демонстрират значението на имунните фактори, като IL-15, за регулиране на мастната тъкан. Бъдещите проучвания трябва да продължат да се фокусират върху определянето на механизма (механизмите), при които IL-15 засяга адипоцитите.

Благодарности

Бихме искали да благодарим на Аатиф Куреши за неговата техническа помощ.

Принос на автора

Замислил и проектирал експериментите: AAA. Изпълнява експериментите: NB MC SR. Анализирани данни: NB. Написа хартията: NB AAA.