I. Култура на водораслите Neochloris Oleoabundans и възстановяване на биомасата

съдържащ

Използваният щам произхожда от алготеката UTEX (колекция от водорасли на Тексаския университет в Остин) и има референтен номер UTEX 1185. Този щам е изолиран в Саудитска Арабия.

В контекста на Примера културата се извършва в периодичен режим в 20 m 3 резервоар, напълнен със солена вода, съдържаща 18 g/l сол, с добавяне на хранителна среда от следния състав:

Витамин В1: 1,10 −4 g/l

Витамин В12: 5,10 −7 g/l

Витамин Н: 5,10 −7 g/l

Също така е възможно да се използва полунепрекъснат режим. Във вида на използвания резервоар културата достига зрялост след 12 до 15 дни.

В края на този период или цялото или част от спирането на водораслите се оттегля.

След това биомасата се концентрира чрез центрофугиране с ускорение от 14000 g (1 g = 9,18 m/s 2).

II. Получаване на екстракти съгласно изобретението

1. Приготвяне на екстракти от първа екстракция с метанол

а. 250 ml метанол се добавят към 100 g биомаса от водорасли, съдържащи 26% сух екстракт в 500 ml колба с кръгло дъно. Сместа се загрява при 65 ° С в продължение на 30 минути под азот. Цялото се центрофугира при 400 об/мин за 10 минути. Течната фаза се отделя от твърдия остатък и се изхвърля. След това филтрационният остатък се прехвърля в 250 ml колба с кръгло дъно и се екстрахира отново с 250 ml метанол при същите условия. Тази операция се повтаря за последен път. Трите течни фази се обединяват и след това се изпаряват до сухо на ротационен изпарител. Получените твърди вещества се разтварят повторно в 100 ml вода и след това се замразяват и лиофилизират. Този екстракт в крайна сметка е под формата на прах и оттук нататък се обозначава като екстракт А.

а.1. Следвайки същата подготвителна схема като тази, описана в точка а), течната фаза, която отново се събира, се изпарява до сухо на ротационен изпарител и след това се разтваря отново, но този път с 200 ml хептан. Цялото се обработва с ултразвук и след това се центрофугира за 30 минути при 4000 об/мин. Супернатантът се извлича, изпарява се до сухо на ротационен изпарител и след това се ресобилизира чрез добавяне на 100 ml дестилирана вода, замразява се и след това се лиофилизира, за да се получи екстракт, който по-долу е означен като А1.

а.2. Следвайки същата схема на екстракция, както описаната за приготвянето на екстракт А в т. 1.а), остатъкът от филтрацията, получен чрез екстракция с метанол, в този случай се разтваря повторно в 100 ml хлороформ и 95 ml вода и 5 ml метанол се добавят. Разделянето течност-течност се извършва между двете фази. Органичната фаза се изхвърля и водната фаза се промива два пъти с 50 ml хлороформ и след това също се изхвърля за приготвянето на екстракта, описан в точка а.3) по-долу. Органичните фази се обединяват и след това се изпаряват до сухо на ротационен изпарител, разтварят се в 50 ml вода и се лиофилизират. Полученият екстракт оттук нататък се обозначава като А2.

а.3. Водната фаза, както е дефинирана в т. А.2), се изпарява на ротационен изпарител, разтваря се отново в 50 ml вода и се лиофилизира, за да се получи екстракт, който по-долу е означен като А3.

2. Приготвяне на екстракт В чрез първа водно-етанолна екстракция и фракциониране на този екстракт

а. Приготвяне на водно-етанолов екстракт Б

250 ml смес етанол/вода (94/4 обем/обем, по-долу v/v) се добавят към 100 g биомаса от водорасли, съдържаща 14,6% сух екстракт в 500 ml колба с кръгло дъно. Сместа се нагрява под обратен хладник в продължение на 30 минути. След охлаждане екстрактът се центрофугира при 4000 об/мин в продължение на 20 минути и остатъкът от центрофугирането се екстрахира отново общо 3 пъти с 250 мл водно-алкохолен разтвор.

Впоследствие супернатантите се обединяват, филтрират се върху фуния на Бюхнер с помощта на 0,40 μm филтър (GF/F, Whatman) и след това се изпаряват до сухо на ротационен изпарител.

Полученият екстракт В след това се разтваря в DMSO при концентрация 5% (тегло/обем, по-нататък w/v) за биологичните тестове.

б. Фракциониране на екстракт В чрез течно-течна преграда за приготвяне на екстракт В1 и екстракт В2

2 g от предишния екстракт В се разреждат в около 80 ml смес етанол/вода (20/40, v/v), за да се получи 2,5% разтвор. Добавят се 53 ml етилацетат за образуване на двуфазна система. Двете фази се разделят, за да се възстанови първата органична фаза. Водната фаза се промива повторно с 53 ml етилацетат и това се повтаря общо 4 пъти. 4-те органични фази се обединяват и след това се изпаряват на ротационен изпарител, за да се получи екстракт, който по-нататък се нарича екстракт B1.

Водната фаза също се изсушава на ротационен изпарител, за да се получи сух екстракт, който оттук нататък се нарича екстракт В2.

Екстракт В1 се разтваря в DMSO при концентрация 5% (w/v) и екстракт B2 се разтваря във вода при концентрация 5% (w/v) за биологичните тестове.

3. Приготвяне на екстракт С чрез първа водно-етанолна екстракция

250 ml смес етанол/вода (96/4, v/v) се добавят към 100 g биомаса от водорасли, съдържаща 12% сух екстракт в 500 ml колба с кръгло дъно. Сместа се нагрява под обратен хладник в продължение на 30 минути. След охлаждане екстрактът се центрофугира при 400 rpm в продължение на 20 минути и остатъкът от центрофугирането се екстрахира отново 3 пъти с 250 ml водно-алкохолен разтвор.

Впоследствие супернатантите се обединяват, филтрират се върху фуния на Büchner (GF/F филтър, Whatman, 40 μm) и след това се изпаряват до сухо на ротационен изпарител. Полученият сух екстракт е екстракт С. След това се разтваря в DMSO при концентрация 5% (w/v) за биологичните тестове.

III. Анализ на липолитичната активност на екстрактите от изобретението

III 1. Принцип на анализа

Целта е да се оцени липолитичната активност на екстракти от Neochloris oleoabundans съгласно изобретението върху експланти на мастни тъкани, които се поддържат живи.

Различните екстракти се включват в хранителната среда при условията, описани по-долу.

След време за контакт от 8 дни, активността се оценява чрез изследване на мастните киселини, отделени в хранителната среда.

III 2. Процедура

Подготовка на 9 експланти на мастните тъкани и поддържането им живи в BEM (Explants Medium на BIO-EC)

Разделяне на експлантите на 3 партиди от 3 експланта:

    • референтна партида, в присъствието на хранителната среда
    • партида, третирана с кофеин като положителна референция
    • партида, обработена с екстракт съгласно изобретението

Тестови продукти:

    • Положителна справка: Кофеинът се използва при крайна концентрация от 0,1% (1 mg/ml) в средата за оцеляване, т.е. при концентрация, десет пъти по-голяма от тази на екстрактите съгласно изобретението, кофеинът вече няма липолитичен ефект при концентрация 0,01% (100 μg/ml).
    • Екстракт от Neochloris съгласно изобретението: Екстрактът е под формата на сух прах, който се разтваря в DMSO при концентрация 50% и след това се разрежда до 1/500 в хранителната среда на експланта, така че да се тества в крайна концентрация от 0,01% (100 μg/ml).

Приложение на екстрактите:

При D0 експлантите се поддържат живи в 2 ml хранителна среда, в която е включен тестовият екстракт.

Това лечение се повтаря при D2, D4 и D6.

При D2, D4, D6 и D8 се взема проба от хранителната среда. За всеки експлант средата, взета от D2, D4, D6 и D8, се комбинира в една и съща епруветка и се съхранява при -20 ° С за изследване на мастните киселини, присъстващи в средата.

Анализ на свободните мастни киселини, присъстващи в средата:

След екстракция на хранителната среда, наличните в нея свободни мастни киселини се отделят и се анализират чрез високоефективна тънкослойна хроматография.

Жизнеспособността и морфологията на адипоцитите се наблюдават чрез хистология. След като се поддържат живи в продължение на 8 дни, референтните и третирани експланти не показват нито видимо разграждане, нито клетъчна некроза.

Липолитичната активност се оценява чрез определяне на пропорциите на свободни мастни киселини, освободени в хранителната среда.

Получените резултати са дадени в таблиците по-долу и съответстват на теглото на мастните киселини, освободени в хранителната среда през осемте дни от лечението, изразени в μg.

а. Резултати, получени с екстракт В съгласно изобретението

Вижда се, че всички тестови екстракти съгласно изобретението имат значителна липолитична активност, доколкото значително количество мастна киселина се освобождава в средата. Тази липолитична активност може дори да се счита за много значима, особено тази на екстракт Bi, тъй като при 0,01% доза, използвана за екстрактите съгласно изобретението, кофеинът, положителна референция, добре известна със своята липолитична активност, вече не е активен.