Пекински институт по гериатрия, болница в Пекин
No.1 Dahua Road, Пекин, 100730 (Китай)
Тел. + 86-10-58115044, факс + 86-10-65237929, E-Mail [email protected]
Сродни статии за „“
- електронна поща
Резюме
Въведение
Поли (ADP-рибоза) полимераза (PARP) е член на семейството ензими, който участва в увреждане и възстановяване на ДНК. PARP може да се активира чрез скъсване на веригите на ДНК, неправилни структури на ДНК или други пост-транслационни модификации [1]. Активирането на PARP може да регулира протеиновата функция, уплътняването на хроматин и генната експресия чрез модифициране на прицелните протеини чрез поли (ADP-рибозил) ация [2]. Прекомерното активиране на PARP обаче може да доведе до клетъчна некроза поради изчерпване на NAD и ATP. Активирането на PARP, което е защитен отговор на увреждане на ДНК, също играе роля при клетъчната дисфункция.
Излишният прием на енергия може да провокира свръхпроизводството на реактивни кислородни видове и да наруши биологичните макромолекули, като по този начин води до метаболитна дисфункция при пациенти със захарен диабет тип 2 [3, 4]. По време на процеса на излишен прием на енергия, PARP се активира от оксидативен стрес и е свързан с метаболитни нарушения на глюкозата. Делецията на PARP1 увеличава митохондриалната биосинтеза и предотвратява инсулиновата резистентност, индуцирана от диета с високо съдържание на мазнини, чрез увеличаване на съдържанието на NAD + и активността SIRT1 при затлъстели мишки [5]. PARP инхибиторът подобрява инсулиновата чувствителност в хепатоцитите чрез модулация NAD-SIRT1. Съответно, инхибирането на PARP играе положителна роля в метаболизма на глюкозата. Независимо от това, ефектът на инхибиторите на PARP върху липидния метаболизъм остава неуловим.
Съобщава се, че делецията на гена PARP1 засилва натрупването на липиди в черния дроб и изостря затлъстяването, предизвикано от мазнини [6]. Полезната функция на PARP може да бъде нарушена, когато генът PARP1 бъде изтрит. Следователно, частичното инхибиране на активирания PARP заслужава да бъде изследвано по отношение на терапията с метаболитна дисфункция. Незабавно трябва да се изясни дали инхибиторите на PARP оказват идентичен ефект върху липидния метаболизъм с делеция на гена PARP1 или не.
За да се оцени ефектът от инхибиторите на PARP върху липидния метаболизъм, третираните с олеинова киселина хепатоцити се третират с PJ34 и моделите на мишки се хранят с диета с високо съдържание на мазнини. Резултатите имат значение за клиничното приложение на PARP инхибиторите при лечението на метаболитни заболявания.
Материали и методи
Клетъчна култура
Клетки от миши хепатом HEP1-6, получени от American Type Culture Collection, се култивират в DMEM (Invitrogen, Grand Island, NY), съдържащ 25 тМ глюкоза, допълнена с 10% фетален говежди серум (Biowest, Франция). Клетките се отглеждат при 37 ℃ в 5% CO2 овлажнена атмосфера. За лечение с високо съдържание на мазнини, клетките бяха третирани с 500µM олеинова киселина (OA, Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО) или BSA (контрола) със или без 3µM PJ34 за 48 часа.
Уестърн блотинг
Протеиновите проби (60 ug, както е определено чрез анализ Bio-Rad, Thermo, Rockford, IL, USA) се разделят с 9% електрофореза на натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел. Анти-поли (ADP-рибоза) полимер (PAR, Trevigen, Gaithersburg, MD), SREBP1 (SANTA CRUZ Biotechnology, CA) и анти-актинови антитела се инкубират за една нощ при 4 ° C. Актинът се използва като контрола за потвърждаване на равното натоварване на протеини.
Количествена PCR в реално време
Обща РНК се екстрахира от чернодробна тъкан или клетки, използвайки Trizol (Invitrogen, Frederick, MD, USA), и cDNA се синтезира от 2 ug от общата РНК, използвайки M-MLV обратна транскриптаза (Invitrogen). PCR в реално време се извършва с помощта на SYBR Green Master Mix Kit в Lightcycler (iQ5, Bio-rad, САЩ). PCR праймери са конструирани за Srebp1a, Srebp1c, Srebp2, Chrebp и Lxrα, въз основа на публикуваните нуклеотидни последователности на миши генни региони (Таблица 1). Hprt служи като ген за вътрешен контрол.
маса 1.
Поредици от праймери, използвани за PCR в реално време
Маслено червено O оцветяване
Чернодробните тъкани бяха фиксирани в 4% параформалдехид и нарязани на 10-μm филийки с помощта на криостат (Leica CM3050S, Германия). Слайдовете се оцветяват с 0,5% маслено червено О (Sigma-Aldrich) в изопропанол в продължение на 30 минути и след това се изплакват в 60% изопропанол и дестилирана вода. Слайдовете бяха запечатани с глицерол и заснети.
Анализ на имунопреципитацията (IP)
Клетъчните лизати се инкубират или с анти-Sp1 антитяло, или с нормален заешки IgG в продължение на една нощ при 4 ° С и след това се добавят протеин-А + G агароза (Beyotime, Китай) при 4 ° в продължение на 4 часа. Имунопреципитатите се гранулират чрез центрофугиране и се промиват 4 пъти с лизисен буфер. След това имунопреципитираните проби се нагряват в SDS пробен буфер и се използват за SDS-PAGE анализ. Неспецифичният IgG беше използван като отрицателна контрола.
Анализ на имунопреципитация на хроматин (ChIP)
Експериментите с ChIP бяха проведени като ръководство за употреба на комплекта за анализ на чипове (Beyotime, Китай). Hep1-6 клетки се обработват с ултразвук и имунопреципитират, като се използват 4 ug Sp1 антитяло (Abcam, Cambridge, MA) или IgG. Срязаната ДНК се пречиства с комплект за екстракция на ДНК и се усилва чрез количествен PCR анализ в реално време. Последователностите на праймера на промотора srebf1 бяха 5’-CCA TCC CTG GCC CTT TAA TCT AAC GA-3 ’(смисъл) и 5’-TTC GGA CTA GGC CCA CGT TAA GGA AA-3’ (антисенс).
Животни и диета
Мъжки мишки C57BL/6 (на възраст от шест до осем седмици) са хранени с нормална диета с високо съдържание на мазнини или диета с високо съдържание на мазнини (D12492, Huafukang, Китай) в продължение на 3 месеца (Таблица 2). Теглото им се наблюдава ежеседмично. След 3 месеца мишките бяха разделени на четири групи (шест мишки на група): (1) мишки с нормална мазнина; (2) нормални мишки с диета с мазнини, получаващи интраперитонеални инжекции от дози от 30 mg/kg PJ34 (Sigma – Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) веднъж дневно в продължение на две седмици; (3) диетични мишки с високо съдържание на мазнини; (4) диети с високо съдържание на мазнини, получаващи лечение с PJ34 (същото като група 2). Всички тези протоколи бяха прегледани и одобрени от местния комитет по етични животни на нормалния университет в Пекин.
Таблица 2.
Състав на експерименталните диети
Тест за толерантност към интраперитонеална глюкоза (IpGTT)
В края на 3-месечното хранене с високо съдържание на мазнини всички мишки са били подложени на тест за толерантност към глюкоза; и след лечение с PJ34 в продължение на две седмици, тестът за глюкозен толеранс се повтаря. Мишките са гладували цяла нощ и след това са получили интраперитонеална инжекция от 2 g глюкоза/kg телесно тегло. Процедурата беше същата като описаната по-рано [7].
Тест за интраперитонеален инсулинов толеранс (IpITT)
След 4 часа на гладно, на мишките се прилага интраперитонеална инжекция от 0,5 U инсулин/kg телесно тегло. Глюкозата се измерва от кръвни проби, взети от върха на опашката на интервали от 15, 30, 60 и 120 минути. Мишките са получили тест за толерантност към инсулин както преди, така и след приложението на PJ34.
Кръвни проби и събиране на тъкани
Мишките се гладуват цяла нощ и се анестезират с използване на пентобарбитал натрий. След евтаназия се събира пълна кръв чрез пробиване на дясната камера на сърцето. Серумът се изолира чрез центрофугиране и се съхранява при –80 ° C. Тъканите се отстраняват, претеглят и съхраняват при –80 ° C. Триглицеридите (TG), общият холестерол (TC), липопротеиновият холестерол с висока плътност (HDL) и липопротеиновият холестерол с ниска плътност (LDL) бяха измерени с помощта на автоматичен анализатор (Hitachi, 7600, 7170A).
Индекси на инсулина и инсулиновата чувствителност
Серумният инсулин се анализира с помощта на търговски комплект за ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (Alpco Diagnostics, Salem, NH, USA), съгласно инструкциите на производителя. Инсулиновата резистентност се оценява по няколко показателя [8]. Използваните формули са показани по-долу:
HOMA-IR = (FBI (µU/ml) × FBG (mmol/L))/22,5
QUICKI = 1/(Log (FBG mg/dL) + log (FBI µU/ml))
HOMA-IR: Оценка на хомеостатичния модел-инсулинова резистентност; QUICKI: количествен индекс за проверка на инсулиновата чувствителност; ФБР: кръвен инсулин на гладно; FBG: кръвна захар на гладно.
Статистически анализ
Данните се изразяват като средната стойност ± стандартното отклонение (SD) или средната стойност ± стандартната грешка на средната стойност (SEM). Сравненията между две средни стойности бяха извършени с помощта на независим t-тест на пробите. За множество сравнения между различни групи данни бяха определени значителни разлики, използвайки еднопосочен ANOVA в софтуера SPSS. За да се тества за разлики във времето, беше използван еднопосочен повторен измерване ANOVA с post-hoc тестове. Разликите между стойностите се считат за значими при P
- Дългосрочни ефекти от увеличения прием на протеини след загуба на тегло върху вътрехепаталното съдържание на липиди и
- Голям прием на сол, свързан с повишена смъртност в ново японско проучване
- Показатели на липидния метаболизъм при деца с дисметаболитна нефропатия, подложени на балнеолечение с
- Нарастващата степен на затлъстяване, свързана с повишени разходи за обществото
- Повишена издръжливост и издръжливост; Oxycise!