Урмила Тате

Катедра по клинична фармакология, Медицински колеж Seth GS и болница KEM, Мумбай, Индия

имунологични

Шубхада Чиплункар

* Chiplunkar Laboratory, Advanced Center for Treatment, Research & Education on Cancer (ACTREC), Tata Memorial Center, Мумбай, Индия

Суприя Бхалерао

** Катедра по клинична фармакология, TNMC & BYL Nair Благотворителна болница, Мумбай, Индия

Адити Кулкарни

† Отделение на Каячикица, MA Адарведична болница Подар, Мумбай, Индия

Раман Гунгралкар

† Отделение на Каячикица, MA Адарведична болница Подар, Мумбай, Индия

Фалгуни Панчал

** Катедра по клинична фармакология, TNMC & BYL Nair Благотворителна болница, Мумбай, Индия

Шамал Ветале

* Chiplunkar Laboratory, Advanced Center for Treatment, Research & Education on Cancer (ACTREC), Tata Memorial Center, Мумбай, Индия

Pradeep Teli

* Chiplunkar Laboratory, Advanced Center for Treatment, Research & Education on Cancer (ACTREC), Tata Memorial Center, Мумбай, Индия

Дипти Кумбхар

** Катедра по клинична фармакология, TNMC & BYL Nair Благотворителна болница, Мумбай, Индия

Ренука Мунши

** Катедра по клинична фармакология, TNMC & BYL Nair Благотворителна болница, Мумбай, Индия

Резюме

Предистория и цели:

Басти (медикаментозна клизма) е популярна аюрведична интервенция, препоръчвана при затлъстяване. Няма обаче данни, които да покажат дали след това лечение настъпват физиологични или биохимични промени. Това проучване е проведено за идентифициране на имунологичните и метаболитни промени при индивиди със затлъстяване след терапевтичен курс на Basti.

Методи:

Тридесет и две лица със затлъстяване (18 и 60 години) с индекс на телесна маса (ИТМ) ≥30 kg/m 2, които са получили терапевтичен курс от 16 клизми (Basti), последван от специфична диета и режим на живот за период от 32 дни лечението им за затлъстяване, са включени в проучването. Клинично изследване, измерване на имунни и метаболитни маркери са направени преди (S1), непосредствено след (S2) и 90 дни след завършване на терапията (S3).

Резултати:

Значително намаление (P Ключови думи: Басти, имунологични маркери, метаболитни маркери, затлъстяване, Панчакарма

Затлъстяването се определя от Световната здравна организация (СЗО) 1 като индекс на телесна маса (ИТМ), равен на или по-голям от 30 kg/m 2. Той е свързан с повишен риск от сърдечно-съдови заболявания 2, 3 и диабет тип 2 поради съпътстващи метаболитни аномалии, включително нарушена глюкоза на гладно, хиперинсулинемия и дислипидемия (характеризираща се с ниско ниво на HDL и високи плазмени триглицериди) 4. Увеличаването на затлъстяването също се свързва с ниски нива на микроелементи поради неадекватен прием на хранителни вещества и/или промени в метаболизма на хранителните вещества 5. Един от отличителните белези на затлъстяването е увеличаване на циркулиращите маркери на оксидативен стрес и нискостепенно възпаление, характеризиращо се с повишени нива на циркулиращ С-реактивен протеин (CRP) и/или други възпалителни цитокини като фактор на туморна некроза алфа (TNF-α) и интерлевкин-6 (IL-6) 6, 7. Съобщава се също, че адипоцитокините като TNF-α или IL-6 са повишени с увеличаване на затлъстяването 8, 9 и са в тясна корелация с CRP, известен възпалителен маркер 10 .

Освен категоричните ползи от промяната в начина на живот, диетата и редовните упражнения, различни фармакологични интервенции са изследвани с ограничен успех. Например, орлистатът, който е одобрен за употреба при затлъстяване 11, води до умерена загуба на тегло от 2,9 kg след 1 до 4 години и употребата му е свързана с много стомашно-чревни странични ефекти 12. За изключително затлъстелия пациент с установени усложнения операцията може да бъде най-подходящата намеса и може да бъде животоспасяваща 13. Въпреки това, поради цената и риска от усложнения, търсенето все още продължава за други ефективни и безопасни лечения. Алтернативните терапии също се използват широко, без необходимите доказателства за полза или безопасност.

Аюрведа, индийската система за традиционна медицина, описва Басти (медикаментозна клизма) като интервенция за много разстройства, особено разстройства на начина на живот, включително затлъстяване 14. Аюрведичните текстове описват показанията и противопоказанията за терапия с Басти 15. Все още обаче нито едно проучване не се е опитвало да документира неговата безопасност и дали тази намеса има някакъв ефект при затлъстели индивиди. При липса на данни, които да покажат дали след това лечение настъпват физиологични или биохимични промени, проведохме това проучване, за да оценим имунологичните и метаболитни променливи при затлъстели индивиди след терапевтичен курс на Basti.

Материал и методи

Тридесет и двама последователни пациенти, посещаващи отделението за вътрешни болести (OPD) на аюрведичната болница MA Podar, Мумбай, Индия, за лечение на затлъстяване, на които е предписано лечение с Basti съгласно аюрведичните критерии 16, бяха поканени да участват в това проучване. Пациенти във възрастовите групи от 18 до 60 години с ИТМ ≥ 30 kg/m2 и съотношение талия-ханш ≥ 1,0 при мъжете и ≥ 0,9 при жените бяха поканени да участват в проучването след получаване на писменото им информирано съгласие. Остро болни пациенти с тежка сърдечна, дихателна, чернодробна и бъбречна дисфункция и бременни или кърмещи жени бяха изключени от проучването. Изследването е проведено през периода от август 2007 г. до декември 2010 г.

Тъй като това беше хипотеза, генерираща доказателство за концептуално проучване, при което искахме да проучим дали са настъпили промени в метаболитните и имунните параметри при пациенти, които са получавали Basti като терапия за затлъстяване, размерът на извадката от най-малко завършени 30 пациенти се счита за подходящ.

След писмено информирано съгласие за участие е взета подробна клинична история от всеки отделен човек и е извършен съответният физически преглед, включващ запис на теглото и измерване на антропометрични данни като съотношение талия-ханш, обиколка на горната част на ръката и коремна обиколка. Кръвна проба (45 ml) се събира асептично от пред-кубиталната вена и се обработва за измерване на различни метаболитни и имунологични параметри. Протоколът за изследване е одобрен от Институционалната комисия по етика на МБА Подар Аюрведична болница, Мумбай.

Пробите бяха кодирани на клиничната площадка и изпратени в лабораторията. След вземане на кръвна проба на изходно ниво (S1), беше започнат предписаният терапевтичен курс от 16 Bastis по редовен модел, както е описано в Charak Samhita (известен като kala basti 15).

На 1-ви ден Anuvasan Basti (маслена клизма) със сусамово масло от 240 ml се прилага през аналния канал с помощта на спринцовка и гумен катетър. На следващия ден Asthapana Basti (клизма с отвара), състояща се от til tail 120 ml, Triphala kwatha (отвара от Terminalia belerica, Terminalia chebula & Phyllanthus emblica) -700 ml, кравешка урина -150 ml, мед 10 g и черна сол 10 g беше администриран. Този курс на алтернативни Anuvasana и Asthapana Basti се прилага шест пъти, а след това Anuvasan Basti четири пъти в последователни дни. По време на курса всеки участник е наблюдаван за симптоми на правилни, неадекватни или свръх ефекти от Anuvasana Basti и Asthapana Basti ежедневно.

След завършване на този курс от 16 дни, участниците бяха посъветвани с диета от хранителни продукти, които са лесно смилаеми като khichadi, moong dal, roti и поискани да избягват пържени и богати на въглехидрати храни, студени напитки и др. По време на Basti . Те също бяха помолени да променят режима си на начин на живот (напр. Да избягват седенето и изправянето за продължителен период, прекомерно/силно говорене, усилено пътуване/ходене на дълги разстояния, дневен сън, потискане на естествените позиви, секс, прекомерно излагане на бриз, слънчева светлина, дим, прах, използване на възглавница с неподходяща дебелина и др.) за период от 32 дни съгласно препоръките на Аюрведа 15. В края на този период курсът на Басти се счита за завършен. Клиничният преглед и изследванията на кръвта бяха повторени (S2) в този момент, както при базовото посещение.

Крайната кръвна проба (S3) беше събрана 90 дни след S2, заедно с клиничното изследване, за да се оцени дали ефектът на Basti се поддържа. През този период не се препоръчват диетични промени или начин на живот или лекарства за контрол на теглото. По този начин участникът е бил под наблюдение общо 138 дни след набирането му в проучването. Денят, в който е взета проба 1 (S1), е определен като ден 0, S2 - в ден 48 (16 дни на Басти и 32 дни в ограниченията за начина на живот и диета) и S3 в ден 138. Антропометрични параметри като тегло, ИТМ, талия - съотношение на тазобедрената става, обиколката на горната част на ръката и корема са измерени по време на колекциите S1, S2 и S3.

Изолирането на лимфоцити от периферна кръв (PBL) се извършва от хепаринизираната периферна венозна кръв чрез метод на центрофугиране Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich, САЩ) 17 .

Имунофенотипизиране на лимфоцити в периферната кръв (PBL): PBLs са инкубирани с белязани с фикоеритрин (PE) миши анти-човешки моноклонални антитела (MAb), насочени срещу CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD56, CD80, CD86, CD209, CD11c, αβ -T клетъчен рецептор (TCR) и γδ-TCR (BD Pharmingen, САЩ) за повърхностно оцветяване съгласно инструкциите на производителя. Маркерите за активиране бяха оценени чрез използване на двуцветна поточна цитометрия. PBLs бяха оцветени с конюгирани с флуорохром моноклонални антитела срещу маркери за активиране като флуоресцеин 5-изотиоцианат (FITC) конюгирани CD25, CD69, CD71 и PE-конюгиран HLA-DR (BD Pharmingen, САЩ) и допълнително инкубирани с FITC или PE конюгирани миши анти- човешко моноклонално антитяло, насочено срещу CD3. Във всички експерименти са използвани подходящи контроли за изотип. PBL са получени на поточен цитометър FACSCalibur (Becton Dickinson, САЩ). Данните са анализирани със софтуера CellQuest (Becton Dickinson, САЩ).

Оценка на вътреклетъчното освобождаване на калций: PBL (1x10 6/ml 0,01 М PBS) се зареждат с 5 цМ Fluo-3-AM за 30 минути при 37 ° С. Един µg анти-CD3 MAb се добавя като стимулант и интензивността на флуоресценцията се измерва незабавно на поточния цитометър FACSCalibur за определяне на вътреклетъчното освобождаване на калций в различни моменти от времето, както е описано по-рано 18 .

Измерване на вътреклетъчните реактивни кислородни видове в лимфоцитите: Нивото на реактивните кислородни видове (ROS) в PBL беше измерено с помощта на 2 ’, 7’ дихлорфлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) багрило (Sigma, САЩ). PBL се зареждат с 4 μM багрило и се инкубират в продължение на 30 минути при 37 ° С. Anti-CD3 MAb (1 μg) беше добавен като стимулант и беше измерено увеличение на средната интензивност на флуоресценция от 0 до 45 минути, както е описано по-рано 19. Анализът беше извършен с помощта на софтуера Cell Quest и резултатите бяха изразени като средна интензивност на флуоресценция (MFI).

Оборот на лимфоцитите чрез оцветяване с анексин FITC: PBL се инкубират с PE маркирани миши анти-човешки моноклонални антитела, насочени срещу CD3 и CD19 (BD Pharmingen, САЩ) за повърхностно оцветяване. Оборотът на лимфоцитите (апоптоза) беше допълнително наблюдаван чрез метод за оцветяване на анексин V FITC (BD Pharmingen, САЩ) съгласно указанията на производителя и данните, анализирани с помощта на софтуера Cell Quest.

Тест за пролиферация на лимфоцити: Пролиферативните отговори при PBLs са анализирани, като се използва тритиран анализ за включване на тимидин, съгласно стандартен протокол 20. Като стимулант се използва анти-CD3 MAb (1 ug). Включването на тритииран тимидин се измерва в течен бета сцинтилационен брояч (Модел 1900, Packard, САЩ) като брой в минута (cpm). Индексът на стимулация (S.I.) се изчислява като съотношение на средната cpm култури, стимулирани с анти-CD3 MAb и нестимулирани култури.

ELISA за цитокини и имуноглобулин: PBL (1.5x10 5/200 ul cRPMI/ямка) се стимулират с 1 ug анти-CD3 MAb в продължение на 48 часа при 37 ° С. Безклетъчните супернатанти бяха събрани и анализирани за секретирани цитокини интерферон гама (IFN-y), интерлевкин (IL) -10, IL-4, IL-8, TNF-α, IL-6 и IL-1α с помощта на Opt-EIA сандвич Комплект ELISA (BD, Biosciences, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Серумните проби също бяха анализирани за гореспоменатите цитокини, използвайки същите комплекти.

Нивата на имуноглобулини, IgG и IgM в серумни проби от индивиди със затлъстяване са измервани с помощта на комплект за откриване на IgG и IgM (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA) съгласно препоръките на производителя.

Анализ на цитотоксичността: Цитотоксичността на лимфоцитите се наблюдава чрез анализ на освобождаване на 51 Cr. PBLs (ефектори) се култивират съвместно с 51 Cr-белязани мишени K562 (5000 клетки на гнездо) в ефектор към таргет E: Т клетъчни съотношения 40: 1, за 4 h при 37 ° C, съгласно стандартен протокол 21. Процентът на цитотоксичната активност се изчислява, като се използва следната формула:% специфичен лизис = (проба cpm - спонтанна cpm)/(максимална cpm - спонтанна cpm) × 100.

Пълна кръвна картина (CBC) е направена на хематологичен анализатор SYSMEX KX-21 (Sysmex Corporation, Кобе, Япония) и скоростта на утаяване на еритроцитите (ESR) е направена по метода на Вестергрен 22 .

Кръвна захар на гладно, чернодробни функционални тестове [серумен билирубин, серумна аланин трансаминаза (ALT), аспартат трансаминаза (AST) алкална фосфатаза (ALP), γ-глутамил трансфераза GGT], тестове за бъбречна функция (азот на урея в кръвта, серумен креатинин, протеин, албумин и пикочна киселина), минерали (серумен калций, фосфор, желязо и мед), липиден профил (серумен холестерол, триглицериди, HDL-холестерол и LDL-холестерол) са анализирани с помощта на стандартни биохимични комплекти (AMP Diagnostics, Австрия) на напълно автоматизирана биохимична анализатор (Biochemical Systems International SRL, Италия). Инсулинът на гладно, витамин В12 и ендокринните маркери (Т3, Т4, TSH, кортизол) се измерват с помощта на стандартни комплекти за радиоимуноанализ (Shinjin Medics Inc., Южна Корея). Оценката на хомеостатичния модел-инсулинова резистентност (HOMA-IR) е изчислена по формулата [Захар (mmol/l) x инсулин]/22,5. Гликозилираният хемоглобин и високочувствителният (hs) -CRP бяха измерени с помощта на Nycocard Reader (Axis Shield, Норвегия). Нивата на витамин А бяха измерени с помощта на стандартен HPLC комплект (Recipe Chemicals, + Instruments, GmBH Германия). Нивата на феритин са измерени с помощта на стандартни ELISA комплекти (Calabasas, CA, USA).

За осигуряване на качеството бяха обработени както вътрешен, така и външен контрол на качеството (получени от Christian Medical College, Vellore, India и BIO RAD, USA). За да се запази целостта на метаболитните данни, всички комплекти, доставени за анализ на параметрите, се поддържат постоянни през цялото проучване.