Катедра по фармакология, Факултет по основни медицински науки, Пекински университет,

полизахариден

38 Xueyuan Road, Haidian District, Пекин, 100191 (Китай)

Факс 0086-10-82805622, E-Mail [email protected]

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) се отнася до чернодробна стеатоза, представляваща повече от 5% ~ 10% от общото тегло на черния дроб или макростеатоза в същата степен, което не е причинено от прекомерна консумация на алкохол или други ясни хепатотоксични фактори [1]. NAFLD е клинично-патологично определена единица, най-често свързана със затлъстяване, инсулинова резистентност (IR), диабет, хипертония, дислипидемия, атеросклероза, системно възпаление и други метаболитни синдроми. NAFLD засяга около 30% от общото население в развитите страни и нараства до 70% при пациенти със захарен диабет тип 2 (T2DM) или 90% при пациенти със затлъстяване [2, 3]. NAFLD обхваща редица патологични промени, вариращи от стеатоза до стеатохепатит (NASH), които могат да прогресират до цироза и хепатоцелуларен карцином.

В момента има различни терапии за NAFLD, като промяна на диетата, упражнения за отслабване и използване на лекарства като понижаващи липидите лекарства (статини), хипогликемични лекарства (тиазолидиндион и метформин), както и антиоксиданти (витамин Е и ацетилцистеин). Въпреки това, всички тези терапии са затруднени от някои ограничения и странични ефекти [4]. Досега нито една терапия не е в състояние да спре или обърне NAFLD или NASH. Необходимо е да се открият нови лекарства и ефективни терапии за NAFLD.

Ganoderma lucidum (известен също като lingzhi или reishi) е традиционно китайско лекарство, което се консумира заради широките си лечебни свойства в Азия в продължение на хиляди години [5]. Ganoderma lucidum е широко използван за профилактика и лечение на различни медицински заболявания, включително рак [6, 7], увреждане на черния дроб, предизвикано от хепатотоксични лекарства [8, 9], увреждане на бъбреците [10], особено за метаболитни заболявания като диабет [11], затлъстяване [12] и други сърдечно-съдови синдроми [13]. Ganoderma lucidum полизахариден пептид (GLPP), група екстракт от Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Карст с молекулно тегло приблизително 5 × 10 5, което съотношение на полизахарид към пептид е приблизително 95%/5% [14]. GLPP е една от основните фармакологични съставки на Ganoderma lucidum и има разнообразна биоактивност [15]. Нашето предишно проучване разкри, че GLPP предотвратява реперфузионно увреждане на бъбречната исхемия чрез противодействие на оксидативния стрес [10]. Освен това, рандомизирано, двойно-сляпо плацебо контролирано кръстосано проучване показва, че полизахаридните пептиди обогатяват Ganoderma lucidum притежава антиоксидация и хепатопротекция при здрави доброволци [16]. Дали обаче GLPP може да предпази от NAFLD и свързания с него механизъм, остава неизвестно.

В настоящото изследване използвахме ob/ob мишки и аполипопротеин CIII (ApoC3) трансгенни мишки като in vivo експериментални модели за оценка на ефекта на GLPP върху NAFLD и изясняват механизмите, използвайки метаболомика, комбинирана с KEGG и PIUmet анализ. HepG2 клетки и първични хепатоцити, индуцирани от олеинова киселина и палмитинова киселина като инвитро използвани са модели, за да се убедят доказателствата за GLPP за чернодробна стеатоза. Нашите резултати показват, че GLPP има терапевтичен ефект върху NAFLD чрез промяна на класическия път на синтеза на жлъчни киселини (BAs), регулиран от механизъм, зависим от FXR-SHP/FGF, и инхибиране на пътя на синтеза на мастни киселини надолу по веригата. Експерименталните резултати предполагат, че GLPP е кандидат-лекарство за лечение на NAFLD.

Материали и методи

Реактиви и антитела

Животни

Тест за толерантност към глюкоза (GTT) и тест за толерантност към инсулин (ITT)

За GTT мишките бяха на гладно в продължение на 6 часа и декстрозата (1.5 g/kg) се прилага интраперитонеално. Нивата на кръвната глюкоза се измерват от опашката преди приложение на декстроза и 15, 30, 60, 90 и 120 минути след приложението. За ITT мишките са гладували в продължение на 6 часа, започвайки от 8 часа сутринта и продължаващи до 14 часа. Рекомбинантен човешки инсулин (1 IU/kg) се прилага интраперитонеално. Нивата на кръвната захар се измерват от опашката преди приложението на инсулин и 15, 30, 60, 90 и 120 минути след приложението.

Събиране на проби от серум и тъкани

В края на експеримента кръвта се събира чрез venae orbitaeta и се центрофугира при 5000 rpm в продължение на 10 минути при 4 ° C. Серумът се съхранява при -80 ° С за метаболомичен анализ и биохимичен анализ. След евтаназия на мишките, черният дроб, бъбреците, далака, висцералната мастна тъкан и епидидималната мастна тъкан се събират за хистопатологично наблюдение или се съхраняват при -80 ° C, като се замразяват бързо до анализ.

Биохимичен анализ

Измерихме плазмената глюкоза чрез пробен комплект (Shanghai Rongsheng Biotech Co., Ltd) в съответствие с инструкциите на производителя. Плазмените TG, TC, HDL-c, LDL-c, ALT и AST бяха измерени с помощта на автоматичен анализатор (AU5800 се доставя с реагент за йонен тест, Beckman Coulter Commercial Enterprise CO., Ltd.).

Анализ на съдържанието на чернодробни липиди

За чернодробна липидна екстракция чернодробните проби се претеглят и хомогенизират. Четири милилитра хлороформ/метанол (2/1, v/v) се добавят към хомогенизирането и се завихря за 30 s. Получената смес се центрофугира при 836 х g за 30 минути. След това супернатантата се извежда в нова епруветка за по-нататъшно извличане на липиди, използвайки същия метод, както беше споменато по-горе. Долният слой липидна екстракция беше отнесен в друга нова епруветка. След като органичните разтворители напълно се изпаряват, остатъкът се разтваря в 500 μL 3% Triton-X 100. Общото съдържание на TC и TG в получения разтвор се определя в съответствие с инструкциите на търговските комплекти (Applygen).

Хистологичен анализ

Чернодробните и мастните тъкани бяха фиксирани в 4% параформалдехид и вградени в парафин и 5 μm срезове бяха изрязани и оцветени с H＆E оцветяване за хистологичен анализ. Чернодробни проби, вградени в OCT съединение (Tissue-Tek® OCT TM Compound, Sakura Finetek USA), бяха нарязани и оцветени с маслено червено О и оцветени с хематоксилин, за да се визуализират вътреклетъчните капчици. Всички цифрови изображения са получени със светлинен микроскоп (Leica, Wetzlar, Hesse-Darmstadt, Германия).

Полуколичествен анализ с маслено червено

Липидните капчици са оцветени с червен цвят на фона на бяло, а ядрата са оцветени в синьо. Съдържанието на липиди се определя количествено чрез израстването на червения канал. След субстратиране на минимални стойности на три цветни канала, остатъкът от червения канал се третира като количеството съдържание на липиди. По същия начин остатъкът от синия канал се третира като количество ядро. Всички региони бяха анализирани еднакво. Примерът от код е показан както следва.