Резюме

  • AQP7, аквапорин 7
  • C/EBP, CCAAT/енхансер свързващ протеин
  • FFA, свободна мастна киселина
  • HWE, Харди-Вайнберг равновесие
  • LD, неравновесие на връзката
  • MAF, малка алелна честота
  • PPAR, рецептор, активиран от пероксизомен пролифератор
  • RXR, ретиноиден X рецептор
  • SNP, единичен нуклеотиден полиморфизъм
  • UTR, непреведен регион

Затлъстяването и свързаните с него аномалии, включително диабет тип 2 и дислипидемия, се превръщат в епидемия, като по този начин представляват големи здравословни проблеми (1). Въпреки че тези аномалии имат ясен генетичен компонент, участващите гени са предимно неизвестни (2,3).

channel

Мастната тъкан е ендокринен орган, който адаптира метаболитните потоци към количеството съхранена енергия (4). Когато се изисква енергия, триглицеридите на мастната тъкан се хидролизират до свободна мастна киселина (FFA) и глицерол (5). Глицеролът служи като субстрат на глюконеогенезата в черния дроб и при определени обстоятелства също като източник на глицерол-3-фосфат за ресинтеза на триглицериди в адипоцитите (6,7). По този начин, производството на глицерол и изтичането му от адипоцити модулира липидната и глюкозната хомеостаза и в крайна сметка контрола на телесното тегло (6,8).

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Набиране на проучване за контрол на случая за връзка с диабет тип 2.

Анализ на електрофоретична подвижност.

Експресия на AQP7 в човешка подкожна мастна тъкан.

Общи проби от РНК са получени от подкожна мастна тъкан от 13 недиабетни, нелекувани, 3-месечни стабилни в теглото индивиди, които са претърпели елективна коремна операция (холецистектомия или бариатрична [съответно при лица, страдащи от затлъстяване или при затлъстяване]). Един микрограм от всяка РНК проба се транскрибира обратно в cDNA, като се използва T-грундираният комплект от първа верига Ready-To-Go (Amersham) съгласно протокола на производителя. След това експресията на гена AQP7 беше оценена чрез PCR в реално време, използвайки предварително направени маркирани с Fam анализи TaqMan (Applied Biosystem). Реакциите бяха проведени на система за откриване на последователност ABI Prism 7000HT (Applied Biosystems). Генът за домакинско домакинство GAPDH (4333764F) е използван като референция за нормализиране на нивата на експресия на AQP7 (Hs00357359_m1), като по този начин се компенсират всякакви разлики в ефективността на обратната транскриптаза. Всички проби бяха анализирани в три екземпляра. Данните бяха получени като стойности на Ct съгласно указанията на производителя. Сгънатите промени в генната експресия бяха изчислени по метода 2 ΔΔCt (21).

Статистически анализ.

Стойностите се отчитат като средна стойност ± SD. Сравненията между групите бяха тествани чрез несдвоен t-тест на Student. Сравненията между групите бяха тествани от еднопосочна ANOVA. Средните стойности, след коригиране за ковариати, бяха оценени чрез тест ANCOVA. В проучването случай-контрол се използва χ2 тест за тестване на връзката между диабет тип 2 и генотип и за тестване на равновесието на Харди-Вайнберг (HWE). За моделиране на ефекта от различните генотипове върху риска от заболяване е използван многовариатен логистичен регресионен анализ. Взаимодействието между A-953G SNP и пола върху риска от диабет тип 2 и върху стойностите на ИТМ е тествано съответно чрез логистичен регресионен анализ и общ линеен модел. Всички анализи бяха извършени с помощта на софтуерната програма SPSS, версия 12.0 за Windows (Чикаго, Илинойс).

Мерките за неравновесия по двойки (D 'и r 2) бяха изчислени между полиморфизми от софтуерни програми PHASE (22) версия 2.0 и Haploview (23) версия 3.32. Haploview също се използва за идентифициране на хаплоблокове, които се определят като твърди бодли с неравновесие на връзката (LD) (D ′> 0,9).

PHASE също се използва за реконструкция на отделни хаплотипове. Анализите на хаплотипната асоциация са извършени с помощта на Haplo Stats (24) и се считат за незначителни, ако емпиричната глобална P стойност е ≥ 0,05.

РЕЗУЛТАТИ

Повторно определяне и оценка на LD.

Използвайки данни на HapMap (издание 20/Gen06), беше оценена структурата на хаплоблока на пробата от CEPH от жители на Юта с европейски произход (група CEU). Определяйки солиден гръбначен стълб на LD като D ′> 0,90, шест хаплоблока през ∼50 kb от геномната област, обхващащи локуса AQP7 (фиг. 1 и онлайн приложение Таблица 1 [достъпно на http://dx.doi.org/10.2337/db06 -1389]) бяха идентифицирани. Моделът на LD, наблюдаван в този регион, беше доста скромен. По-подробно се наблюдава силно запазена LD в 5 ′ региона на гена AQP7, докато малко значима LD се открива между 5 ′ и 3 ′ области (онлайн приложение Фиг. 1).

За да се проверят и/или идентифицират нови варианти на AQP7 в нашата популация, целият кодиращ регион (седем екзона) и регулаторни последователности, както 5 ′, така и 3 ′ UTR и 2,5 kb от промотора (18), бяха повторно проследени в скринингова проба, състояща се от 50 индивида (25 здрави субекта и 25 пациенти със затлъстяване от диабет тип 2). В кодиращия регион не бяха идентифицирани варианти, включително описаните по-рано мисенс мутации (18), докато пет SNP, вече докладвани в публичната база данни (Национален център за биотехнологична информация dbSNP), бяха разпознати в регулаторните региони: rs13434 (малка алелна честота [MAF ] = 0,04), rs2989924 (MAF = 0,46), rs3758269 (MAF = 0,11), rs3758268 (MAF = 0,07) и rs3758267 (MAF = 0,11); rs13434 се намира в 3 ′ UTR, а останалите четири в промотора (Фиг. 1). LD степента, оценена сред SNP в нашата скринингова проба, е много подобна на тази, получена с пробата CEU в HapMap, със силно запазен LD, наблюдаван само в 5 ′ региона на гена (онлайн приложение Фиг. 2).

Измерванията на неравновесие по двойки показват, че rs3758269 (който не е генотипиран в пробата HapMap) е в перфектна LD (r 2 = 1) с rs3758267, но не и с rs2989924 (r 2 = 0,1). Забележително е, че както rs3758269, така и rs2989924 са близо до предвиденото място на свързване за транскрипционен фактор C/EBPβ (18). Въз основа на техните MAF (т.е. с изключение на необичайни варианти, дефинирани като MAF 2, 24,8 ± 2; n = 275) спрямо заболелите със затлъстяване (BMI ≥40 kg/m 2, 48,1 ± 6; n = 211) субекти. Както е показано в таблица 3, делът на индивидите с XG е значително по-висок при заболели от затлъстяване, отколкото при неносебни жени; това, за разлика от това, не беше случаят при мъжете.

KO мишките за гена AQP7 показват повишени серумни нива на FFA като последица от вътреклетъчното метаболитно разстройство на адипоцитите (6). За да се изследва дали A-953G SNP е имал роля върху серумните концентрации на FFA, 541 недиабетни, здрави индивида (338 жени на възраст 36 ± 12 години, ИТМ 24,9 ± 4,8 kg/m 2 и 203 мъже на възраст 37 ± 12 години, ИТМ 26,4 ± 3,9 kg/m 2). В сравнение с индивидите с АА, нивата на FFA са по-високи при носители на XG сред субектите (0,55 ± 0,2 срещу 0,60 ± 0,2 mmol/l, съответно AA срещу XG, коригирано възрастово P = 0,040), но не и при мъжете (0,58 ± 0,3 срещу 0,54 ± 0,2 mmol/l, AA срещу XG, съответно, P = 0,363, след коригиране на възрастта). Статистическата значимост при субектите при жените не се е променила много (P = 0,045) след също корекция за ИТМ, чиито средни стойности не са различни при различните генотипни групи (24,9 ± 4,7 и 24,9 ± 4,9 kg/m 2 при индивиди AA и XG, съответно, P = 0,918) най-вероятно, тъй като според критериите за подбор това са здрави и предимно млади и неблагополучни индивиди (вж. Дизайн и методи на изследване).

Функционални изследвания и изследвания на генната експресия.

За да се изследва дали A-953G SNP влияе на промоторната транскрипционна активност, анализът на луциферазен репортерен ген се провежда в COS1 клетки, трансфектирани или с A- или G-953 вариант (Фиг. 2А). В същите клетки, cDNAs както на PPARγ2, така и на RXRα, които са съществени транскрипционни фактори за промоторната активност на AQP7 (26), бяха котрансфектирани. При стимулация с различни концентрации на розиглитазон, промоторът -953G показва ~ 50% намаляване на транскрипционната активност в сравнение с промотора -953A (n = 3, P = 0.001) (фиг. 2В). Трябва да се отбележи, че вариантът -953G е 7 bp близо до прогнозирания елемент на свързване на транскрипционен фактор C/EBPβ (18), за който е известно, че е основен играч в диференциацията на адипоцитите (27). След това беше извършен анализ на смяна на гела, за да се изследва дали A-953G SNP влияе върху свързването на C/EBPβ. В сравнение с радиомаркирания олигонуклеотид, носещ −953A, този, носещ варианта −953G, показва 30 ± 7% намалено свързване с C/EBPβ (n = 3, P = 0.01) (Фиг. 3). Това предполага, че намаленото свързване на C/EBPβ-ДНК е отговорно, поне отчасти, за нарушената транскрипционна активност на AQP7, показана от промотора -953G.

Също така имахме възможността да измерим нивата на експресия на AQP7 в подкожната мастна тъкан на 13 нелекувани недиабетни индивиди: 8 (3 мъже/5 жени, на възраст 40,4 ± 11,9 години) не са били в изобилие (ИТМ 2, 23,7 ± 3,0) и 5 ​​(2 мъже/3 жени на възраст 40,2 ± 16,4 години) са били със затлъстяване (ИТМ ≥30 kg/m 2, 43,0 ± 12,2). Затлъстелите лица показаха подчертано (P = 0,001) понижаване на експресията на AQP7 по отношение на лица, които не са с дебелина (фиг. 4А). В допълнение, въпреки че данните се получават при малък брой индивиди и поради това трябва да се интерпретират с голямо внимание, нивата на mQKK на AQP7 изглежда прогресивно намаляват според броя на алелите -953G (от нула до два алела в AA, AG и GG индивиди, съответно, P = 0,036 чрез анализ на линейна регресия), като A-953G SNP е в състояние да предскаже 34% от променливостта на нивото на иРНК на AQP7 (фиг. 4В). Въпреки че тази връзка вече не е била значима, когато се коригира за ИТМ (P = 0,085), тя все още е била забележима, когато са анализирани само неблагополучни индивиди (r 2 = 0,68, P = 0,012), като по този начин се оставя отворена възможността за директен ефект на - Вариант 953G за in vivo експресия на AQP7, независимо от промените в ИТМ.

ДИСКУСИЯ

Въпреки по-високите нива на FFA, не са наблюдавани доказателства за инсулинова резистентност (т.е., както е показано от сурогати на това състояние, включително серумни нива на инсулин и/или индекс за оценка на модела на хомеостаза) при недиабетно нелекувани носители -953G. Тази констатация вероятно се дължи на ниската чувствителност на сурогатите при откриване на фини промени в инсулиновата резистентност като тези, които се предполагат от малкото увеличение на циркулиращите концентрации на FFA, наблюдавани при носители -953G.

Всички асоциации генотип-фенотип, които наблюдавахме, изглежда са специфични за пола, като се наблюдават сред жени, но не и мъже. В действителност, специфичен за пола генетичен ефект върху модулацията на ИТМ е докладван по-рано в няколко животински модели (28, 29), както и при хора (30). Освен това се съобщава за сексуален диморфизъм при модулирането на циркулиращата концентрация на FFA (31), което може да се дължи на специфичен за пола генетичен ефект, като този, който описваме тук. Дали сексуалната специфичност, която наблюдаваме, се дължи на взаимодействието на гена AQP7 със свързани с пола гени и/или ефекти на сексуалния хормон, не е известно и заслужава допълнителни, специално разработени проучвания.

Трябва да се отбележи, че сме извършили пълна повторна последователност на кодиране и регулаторни, но не и на интронни региони, която според последното издание на HapMap (21 юли 2006 г.) съдържа само два интрагенни общи варианта, единият от които се намира в рекомбинантна гореща точка. Поради това, поради тези вътрешни ограничения, проучването, което успяхме да проектираме, не представлява цялостно изследване на целия ген на AQP7 и всъщност е ограничено главно до промоторния регион. Това оставя отворена възможността други неидентифицирани SNP да се окажат свързани със затлъстяването и свързаните с тях аномалии.

Ние признаваме, че при сложни разстройства асоциациите генотип-фенотип могат да представляват фалшиво положителни резултати поради стратификация на популацията и/или шанс. Изглежда, че това не е случаят на настоящото проучване поради следните причини. Първо, изследваната популация е относително хомогенна, като всички индивиди са кавказци от Централна Италия, което прави възможността за стратификация на населението далечна. Второ, асоциацията с повишен ИТМ се възпроизвежда във втора независима извадка. И накрая, данните за експресията в мастната тъкан и функционалните изследвания в трансфектираните клетки ясно подкрепят биологичната роля на варианта -953G в отрицателно модулиращата експресия на AQP7. Тези данни засилват правдоподобността на наблюдаваната асоциация генотип-фенотип. Следователно, въпреки че понастоящем нашите данни не могат да се твърдят като окончателни, те е малко вероятно да представляват фалшиво положителни констатации и могат да служат на функцията на новата хипотеза, генерираща да бъде недвусмислено потвърдена в по-нататъшни по-големи проучвания.

В заключение, настоящите данни, получени при носители на -953G, много приличат на тези, получени при мишки AQP7 KO (6), като по този начин се предполага, че и при хората понижаването на регулирането на AQP7 е патогенно за затлъстяването и свързаните с него аномалии, което прави AQP7 нова атрактивна лекарствена цел. Трябва да се отбележи, че тиазолидиндионите, наскоро разработените инсулинови сенсибилизатори, използвани в момента за лечение на диабет тип 2, повишават експресията на AQP7 (26,32). Ако данните за варианта −953G се потвърдят в допълнителни проучвания, те могат да служат на важна функция за подпомагане на идентифицирането на рискови индивиди, към които трябва да се насочат конкретни и ранни превантивни стратегии.