Хранителна имунология
Тази статия е част от изследователската тема
Взаимодействие между храненето, чревната микробиота и имунната система Вижте всички 9 статии
Редактиран от
Рейналдо Б. Ория
Федерален университет в Сеара, Бразилия
Прегледан от
Юджи Найто
Медицински университет в Киото, Япония
Ракел Хонтецилас
Вирджиния Тех, САЩ
Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.
- Изтеглете статия
- Изтеглете PDF
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Допълнителни
Материал
- Цитат за износ
- EndNote
- Референтен мениджър
- Прост ТЕКСТ файл
- BibTex
СПОДЕЛИ НА
Оригинални изследвания СТАТИЯ
- 1 Обединено училище за селскостопански науки, Университет Гифу, Гифу, Япония
- 2 Висше училище по естествени науки и технологии, Университет Гифу, Гифу, Япония
- 3 Катедра по приложни науки за живота, Факултет по приложни биологични науки, Университет Гифу, Гифу, Япония
- 4 Център за силно напреднала интеграция на нано и науките за живота (G-CHAIN), Университет Гифу, Гифу, Япония
Въведение
Възпалителните заболявания на червата (IBD), състоящи се главно от улцерозен колит и болест на Crohn, са идиопатични възпалителни нарушения на стомашно-чревния тракт. Епидемиологичните проучвания показват, че над 1,2 милиона души в Северна Америка и 2 милиона души в Европа са страдали от IBD (1–4), с разпространение, което надхвърля 0,3% в Северна Америка, Океания и Европа. В допълнение, разпространението на IBD нараства не само в развитите страни, но и в новоиндустриализираните страни в Африка, Азия и Южна Америка (5). Въпреки че точната етиология на IBD остава неясна, се смята, че те са резултат от отклонен имунен отговор на лигавицата към коменсалната микрофлора в червата в комбинация с чувствителни генотипове (6). В допълнение към генетичните фактори, хранителните навици също са свързани с развитието на IBD.
Пектинът принадлежи към семейство от сложни полизахариди и е основен компонент на средната ламела в сухоземните растения. Пектинът се състои главно от линеен хомо-полимер от остатъци на α-1,4-свързана D-галактуронова киселина (основна верига), който е частично естерифициран с метилова и ацетилова групи. Степента на метилна естерификация (DM) на пектина се различава между растителните видове и влияе върху ферментацията в сляпото черво, производството на SCFA и противовъзпалителната активност (17, 20). В допълнение, основната верига на пектина е ковалентно свързана с рамногалактуронан (RG) -I и RG-II (21), като и двете изграждат регионите на страничната верига в молекулата на пектина. RG-I се състои главно от неутрални захарни вериги, включително арабинан, галактан и арабиногалактан, докато RG-II се състои от галактоза, арабиноза, рамноза, апиоза, оцетна киселина, 3-дезокси-ликсо-2-хептулосаринова киселина и 3-дезокси- мано-2-октулозонова киселина. Въпреки че съдържанието на пектин в страничната верига също варира между растителните видове (22), няма ясни доказателства, които да демонстрират защитен ефект на съдържанието на страничната верига сами по себе си срещу стомашно-чревни възпаления.
Нашето предишно проучване демонстрира, че пектинът потиска производството на възпалителни цитокини в клетките на Peyer CD11c + и намалява системното възпаление при мишки (16). Освен това, противовъзпалителният ефект изисква неутралната странична верига на захар от пектин. Съответно предположихме, че страничната верига на пектина упражнява своя защитен ефект срещу колит чрез модулиране на производството на SCFAs на дебелото черво и/или пряко взаимодействие с чревни клетки гостоприемници. В настоящото проучване изследвахме ролята на пектиновите странични вериги в миши модел на експериментален колит, използвайки диетични пектини с високо и ниско съдържание на странична верига, и изследвахме възможния механизъм за неговия антиколитен ефект.
Материали и методи
Реактиви
Цитрусовият пектин (получен от лимонови и варови кори) и портокаловият пектин бяха любезно предоставени от CP Kelco ApS (Лил Скенсвед, Дания). Декстран сулфат натрий (DSS) и 2,4,6-тринитробензоена сулфонова киселина (TNBS) и са получени от Wako Pure Chemical Industries (Осака, Япония). Липополизахарид (LPS, Ешерихия коли O111: B4) и Pam3CSK4 са закупени съответно от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ) и Tocris Bioscience (Бристол, Великобритания).
Мъжки мишки C57BL/6 са закупени от CLEA Japan (Shizuoka, Япония) и са настанени в отделни клетки със свободен достъп до вода и храна. Мишките бяха хранени или с AIN-93G диета (контрол без пектин), или с модифицирана AIN-93G диета, допълнена с 5% цитрусов пектин или портокалов пектин за цялото време на експериментите и бяха поддържани при постоянна температура от 23 ° C ± 1 ° C с дневен 12-часов светлинен/12-часов тъмен цикъл. Всички експерименти бяха проведени върху 7-8-седмични мишки.
Индуциран от TNBS колит
TNBS колитът се индуцира съгласно метод, описан от Wirtz et al. (23) с леки изменения. Между 7 и 8 дни преди сенсибилизацията на TNBS, мишките бяха започнати на диети с добавка на пектин и след това бяха сенсибилизирани с 1% TNBS в смес от ацетон и зехтин на задното рамо. Четиринадесет дни след започване на храненето с пектин, мишките бяха леко упоени чрез вдишване на изофлуран (Wako), последвано от интраректално приложение на 100 μL 2,5% TNBS, разтворено в 50% етанол, с помощта на 3,5-Fr катетър, снабден с 1-мл спринцовка. Върхът на катетъра се поставя на 4 cm близо до аналния ръб и мишките се държат в позиция с главата надолу в продължение на 90 s след интраректално инжектиране, за да се осигури разпределение на TNBS разтвора в лумена на дебелото черво. Ежедневно се следи телесното тегло и приема на храна. Дебелото черво и сляпата кишка бяха събрани на 2 или 3 ден след инжектирането на TNBS за допълнителен анализ.
Хистопатология
Пробите от дебелото черво се фиксират в 10% неутрално буфериран формалин за 24 часа. След фиксирането пробите се вграждат в парафин, нарязват се на 4-μm участъци и се оцветяват с хематоксилин и еозин. Хистологичните признаци на колит се оценяват по заслепен начин, като се използва предварително докладвана система за оценка (24), базирана на възпалителна клетъчна инфилтрация и увреждане на тъканите, както следва. Резултат за възпалителна клетъчна инфилтрация: 0 = наличие на случайни възпалителни клетки в ламина проприа; 1 = увеличен брой възпалителни клетки в собствената ламина; 2 = сливане на възпалителни клетки, простиращи се в субмукозата; и 3 = трансмурално разширение на инфилтрата. Точкуване на увреждане на тъканите: 0 = няма увреждане на лигавицата; 1 = лимфоепителни лезии; 2 = повърхностна ерозия на лигавицата или фокална улцерация: и 3 = голямо увреждане на лигавицата и разширяване в по-дълбоки структури на стената на червата.
Приготвяне на клетки Lamina Propria
Клетките на дебелото черво lamina propria се приготвят съгласно метод, описан от Couter et al. (25) с леки изменения. Дебелото черво се събира 2 дни след предизвикване на TNBS и се обръща с помощта на извити форцепс. Тъканта се инкубира в среда RPMI-1640 (Nissui Pharmaceutical, Токио, Япония), съдържаща 5 mM EDTA, 33 μM дитиотреитол (Wako), 1,6% фетален говежди серум (FBS) и 100 единици/ml пеницилин-стрептомицин в продължение на 15 минути при 37 ° С при разбъркване. След инкубацията тъканта се смила и след това се инкубира в RPMI-1640, съдържаща 0,8 mg/ml колагеназа (Wako), 0,04 mg/ml DNase I (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA), 1,2% FBS и 100 единици/ml пеницилин-стрептомицин в продължение на 40 минути при 37 ° С с разбъркване, за да се получи едноклетъчна суспензия. Клетките бяха ресуспендирани в 3 ml 100% Percoll (GE Healthcare, Little Chalfont, Англия) и след това покрити с 3 ml 40% Percoll. Разделянето на градиент на Percoll се извършва чрез центрофугиране при 800 × g в продължение на 20 минути при 4 ° С. Клетките в междинния слой бяха подложени на поточна цитометрия.
Поточна цитометрия
Клетките на дебелото черво lamina propry се инкубират с анти-CD16/32 антитяло (клон 2.4G2, Tonbo Biosciences, Сан Диего, Калифорния, САЩ), за да блокират Fc рецепторите и след това се оцветяват с конюгирано с флуоресцеин изотиоцианат анти-CD4 антитяло (клон RM4-5, Biolegend, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Впоследствие клетките бяха фиксирани и проникнати с набор от буфер за истински ядрен фактор на транскрипция (Biolegend), след това оцветени с конюгирано с фикоеритрин (PE) анти-Foxp3 антитяло (клон MF-14, Biolegend), конюгирано с PE анти-RORγt антитяло (клон B2D, eBioscience, Сан Диего, Калифорния, САЩ) или Alexa fluor 647-конюгирано анти-T-bet антитяло (клон 4B10, Biolegend). След измиване на клетките с буфериран с фосфат физиологичен разтвор, съдържащ 0,5% говежди серумен албумин, интензивността на флуоресценцията се измерва чрез поточна цитометрия (FACSCalibur; BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Данните бяха анализирани с помощта на софтуера CellQuest (BD Biosciences).
Измерване на SCFA
Фекалните проби и съдържанието на цекума са събрани съответно 14 и 17 дни след започване на диетите, допълнени с пектин. Всяка проба (20 mg) се суспендира в съотношение 1:50 (w/v) във вода MilliQ и се разрушава с помощта на циркониеви зърна. След центрофугиране при 10 000 × g за 10 минути, SCFAs в супернатантата бяха измерени с помощта на YMC пакет FA комплект (YMC, Киото, Япония) и система за течна хроматография под високо налягане (HPLC) (PU-2089 Plus, JASCO, Токио, Япония ). Колоната се поддържа при 50 ° С с подвижна фаза, състояща се от ацетонитрил-метанол-вода (30:16:54 v/v/v, рН 4-5, коригирано с 0.1 М HCl), доставена при скорост на потока 0.5 mL/минута. Белязаните SCFAs бяха открити при дължина на вълната 400 nm, като се използва UV/Видим HPLC детектор (UV-2075 Plus, JASCO).
Антибиотично лечение
Антибиотиците са дадени съгласно метод, описан от Chinen et al. (26) с леки изменения. Накратко, на мишките се прилага перорално меропенем трихидрат (50 mg/kg/ден, Wako) и ванкомицин хидрохлорид (50 mg/kg/ден, Wako) 3 дни преди хранене с пектин и след това продължават да получават антибиотици в продължение на 19 дни.
Имуносорбентен анализ, свързан с ензими (ELISA)
Концентрациите на възпалителни цитокини в тъканите на дебелото черво се измерват с търговски комплект ELISA в съответствие с инструкциите на производителя. Мишки IL-1β, IL-6, интерферон (IFN) - γ и нива на тумор некрозис фактор (TNF) -α бяха определени с помощта на Duoset ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) и нивата на IL-17A бяха измерени с IL -17A ELISA комплект (Biolegend). Абсорбцията е измерена при 450 nm с четец за микроплаки (Tecan, Mannedorf, Швейцария). Концентрациите на цитокините в дебелото черво се нормализират до общата концентрация на чревен протеин, както е определено чрез комплект за анализ на бицинхонинова киселина (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA).
DSS-индуциран колит
Мишките са били хранени с пектинови добавки в продължение на 10 дни, преди да получават 3% DSS в питейна вода за 8 дни. Ежедневно се проследяват телесното тегло, индекса на активността на заболяването (DAI) и приема на храна. DAI се изчислява чрез сумиране на предварително докладвани критерии (27) въз основа на следното: процент на загуба на тегло (0 = няма; 1 = 1 до 5%; 2 = 5 до 10%; 3 = 10 до 20%; 4 = > 20%); фекално кървене (0 = без кървене; 1 = няколко изпражнения с кръвно оцветяване; 2 = малко кървене; 3 = грубо кървене; 4 = кръв, изпълваща цялото дебело черво); и консистенция на изпражненията (0 = нормални изпражнения; 1 = леко разхлабени изпражнения; 2 = разхлабени изпражнения; 3 = воднисти изпражнения; 4 = тежка диария). Взети са проби от дебелото черво 8 дни след прилагането на DSS за по-нататъшен анализ.
Ензимно смилане на пектин
Полизахаридите, получени от страничната верига на пектина, са получени, както е описано по-горе (16). Накратко, аликвотни части от 1 mg/ml пектин, разтворени в буфер на оцетна киселина, се смесват с 10 μL разтвор на пектиназа (Pectinex ultra SPL; Sigma-Aldrich) и се инкубират при 50 ° С за 24 часа. Впоследствие реакционният разтвор се диализира срещу дейонизирана вода в продължение на 3 дни, като се използват Spectra/Por диализни мембрани (гранично молекулно тегло, 6000–8000 Da; Spectrum Laboratories, Ранчо Домингес, Калифорния, САЩ) и се лиофилизира. Пълното разграждане на пектина се потвърждава чрез хроматография за изключване на размера.
Клетъчна култура
Клетъчната линия на миши макрофаги RAW264.7 е получена от American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) и е култивирана в модифицирана среда на Dulbecco Eagle (Nissui), допълнена с 10% FBS и 100 единици/ml пеницилин-стрептомицин при 37 ° C под 5% CO2. RAW264.7 клетки се посяват с плътност 3.0 × 105 клетки/ml в 96-гнездни културални плаки и се инкубират с 250 μg/ml пектин или 50 μg/ml получени от странична верига полизахариди за 24 часа. След третиране с пектин, клетките се стимулират с 1 μg/mL LPS или Pam3CSK4 и супернатантите се събират 24 часа след стимулацията за измерване на концентрацията на IL-6 чрез ELISA, както е описано по-горе.
Статистика
Всички резултати са изразени като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност. Данните бяха анализирани чрез еднопосочен дисперсионен анализ, последван от теста на Tukey-Kramer или теста на Dunnett. Разликите между средствата се считат за значителни при P ** P + RORγt + клетки (Th17) е значително намален при хранени с пектин мишки в сравнение с контролните мишки; обаче не е имало значителна разлика между цитрус и портокалов пектин (Фигура 2А), което предполага, че защитният ефект на портокаловия пектин срещу TNBS колит не се дължи на потискане на диференциацията на Th17. Интересното е, че честотата на CD4 + T-bet + (Th1) клетки е значително увеличена само при мишки, хранени с оранжев пектин (Фигура 2В). За разлика от Th17 и Th1, регулаторните Т клетки (Treg), които могат да бъдат дефинирани чрез експресия на Foxp3, са способни да потиснат активирането на Th17 и Th1 клетките чрез производството на IL-10 и да трансформират растежен фактор -β при миши колит модели (29). Съответно изследвахме дали оранжевият пектин увеличава диференциацията на Treg на дебелото черво. Честотата на CD4 + Foxp3 + клетки на дебелото черво (Treg) не се променя чрез хранене с портокалов или цитрусов пектин (Фигура 2С). Тези резултати показват, че храненето с пектин влияе върху диференциацията на Th1 клетките на дебелото черво при тези мишки.
В заключение, настоящото ни проучване предполага, че пектинът отслабва колита поне отчасти чрез страничната му верига. Взети заедно с добре установения пребиотичен ефект на пектина в защитата срещу колит (14, 15), ние предлагаме, че пектинът проявява своите противовъзпалителни ефекти по два начина: зависим от микробиота и независим от микробиота. Тези открития хвърлят светлина върху новия механизъм, чрез който пектинът предпазва от колит и предполагат, че пектинът може да бъде обещаващ профилактичен агент в борбата срещу IBD. Ще бъде необходим допълнителен анализ, за да се изясни подробната структура на страничната верига на неутралната захар, необходима за защита срещу колит.
Декларация за наличност на данни
Всички набори от данни, генерирани за това проучване, са включени в статията/допълнителен материал.
Декларация за етика
Експерименталният дизайн на изследването върху животни е прегледан и одобрен от Комитета за изследване на животните от университета в Гифу, а грижите и използването на животните са били в пълно съответствие с институционалните насоки на университета в Гифу.
Принос на автора
KI, TY и KK са проектирали изследването и са написали статията. KI извърши всички експерименти. TM извърши експериментите с DSS-колит. Всички автори са прочели и одобрили статията.
Финансиране
Това изследване беше подкрепено с безвъзмездни средства (# 16K21075 и # 19K05879 за KK) от Японското общество за насърчаване на науката.
Конфликт на интереси
Авторите декларират, че изследването е проведено при липса на каквито и да било търговски или финансови отношения, които биха могли да се тълкуват като потенциален конфликт на интереси.
Благодарности
Бихме искали да благодарим на CP Kelco ApS в Дания за предоставянето на пектин. Благодарим на Кайоко Такано и Хаято Иритани за изключителна техническа подкрепа на клетъчната култура и на д-р Мишел Камайер-Габе. от Edanz Group за редактиране на проект на този ръкопис.
Допълнителен материал
Допълнителна фигура 1. Схематично представяне на пектиновата структура в цитрусовите и портокалите.
Допълнителна фигура 2. Ефект на пектиновото хранене върху производството на три чревни мастни киселини с къса верига при мишки, предварително третирани с антибиотици (Abx). Фекални проби бяха събрани на 14 дни след хранене с пектин и използвани за определяне на концентрациите на (А) оцетна киселина, (Б) пропионова киселина и (° С) маслена киселина. Стойностите са представени като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност (н = 5).
Допълнителна фигура 3. Ефект от лечението с антибиотик (Abx) върху броя на геномните копия на бактериална 16S рРНК в изпражненията. ДНК се извлича от фекални проби, събрани на 14 дни след хранене с пектин и 16S рРНК гена се определя количествено чрез количествена PCR с бактериални универсални праймери. Стойностите са представени като средни стойности ± SEM (н = 5). a – c, Стойностите, които не споделят обща буква, са значително различни (стр Ключови думи: колит, IL-6, възпаление, макрофаг, пектин
Цитиране: Ishisono K, Mano T, Yabe T и Kitaguchi K (2019) Диетични фибри пектин подобрява експерименталния колит по начин, зависим от неутралната захарна верига. Отпред. Имунол. 10: 2979. doi: 10.3389/fimmu.2019.02979
Получено: 01 септември 2019 г .; Приет: 04 декември 2019 г .;
Публикувано: 19 декември 2019 г.
Рейналдо Б. Ория, Федерален университет в Сеара, Бразилия
Ракел Хонтецилас, Вирджиния Тех, САЩ
Юджи Найто, Медицински университет в Киото, Япония