Affiliations Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental (CIIMAR), Universidade do Porto, Rua dos Bragas 289, 4050-123, Porto, Portugal, Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto (FCUP), 4169-007, Порто, Португалия

labrax

Ендокринологична група по нутригеномика и растеж на рибите, Институт по аквакултури Торе де ла Сал, IATS-CSIC, 12595 Рибера де Кабанес, Кастелон, Испания

Група за патология на рибите, Институт по аквакултури Torre de la Sal, IATS-CSIC, 12595 Ribera de Cabanes, Castellón, Испания

Отделение по микробиология и екология, Биологически факултет, Университет във Валенсия, д-р Moliner 50, 46100 Burjassot, Валенсия, Испания

Партньорски департамент на Biologia Cel·lular, Fisiologia Animal i Immunologia, Universitat Autònoma de Barcelona, ​​Bellaterra, Испания

Affiliation Centro de Ciências do Mar, Universidade do Algarve, Campus de Gambelas, edf. 7, 8005-139, Фаро, Португалия

Affiliations Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental (CIIMAR), Universidade do Porto, Rua dos Bragas 289, 4050-123, Porto, Portugal, Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto (FCUP), 4169-007, Порто, Португалия

Affiliation Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental (CIIMAR), Universidade do Porto, Rua dos Bragas 289, 4050-123, Порто, Португалия

  • Рита Азередо,
  • Жауме Перес-Санчес,
  • Ариадна Ситжа-Бобадила,
  • Белен Фуз,
  • Луис Торт,
  • Cláudia Aragão,
  • Айрес Олива-Телес,
  • Бенджамин Костас

Фигури

Резюме

Цитат: Azeredo R, Pérez-Sánchez J, Sitjà-Bobadilla A, Fouz B, Tort L, Aragão C, et al. (2015) Европейски морски костур (Dicentrarchus labrax) Имунният статус и устойчивостта към заболявания са нарушени от хранителната добавка с аргинин. PLoS ONE 10 (10): e0139967. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139967

Редактор: Даниел Мерифийлд, Университетът в Плимут, ОБЕДИНЕНОТО КРАЛСТВО

Получено: 2 юли 2015 г .; Прието: 18 септември 2015 г .; Публикувано: 8 октомври 2015 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа е частично финансирана от Седмата рамкова програма на Европейския съюз AQUAEXCEL (Инфраструктури за аквакултури за върхови постижения в европейските изследвания на рибите, споразумение за отпускане на безвъзмездни средства № 262336), AQUAIMPROV (справка NORTE-07-0124-FEDER-000038), PEst-C/MAR/LA0015/2013 и UID/Multi/04423/2013. Той беше съфинансиран от Регионалната оперативна програма на Северна Португалия (ON.2 - O Novo Norte), съгласно Националната стратегическа референтна рамка, чрез Европейския фонд за регионално развитие и чрез COMPETE - Програма за оперативна конкурентоспособност и национални фондове чрез Fundação para a Ciência e Tecnologia, съответно. RA и BC бяха подкрепени от Fundação para a Ciência e Tecnologia (отпуска съответно SFRH/BD/89457/2012 и SFRH/BPD/77210/2011). Допълнително финансиране бе получено от Generalitat Valenciana чрез проекта REVIDPAQUA (ISIC/2012/003).

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Най-големите предизвикателства по отношение на средиземноморската аквакултура по отношение на европейския лаврак (Dicentrarchus labrax) са тежките бактериални огнища, настъпващи през цялата година [1]. Сред тях вибриозата причинява най-високите нива на смъртност и следователно големи икономически загуби. Vibrio anguillarum е основният етиологичен агент на вибриозата, често водеща до септицемия, както и кръвоизливи и екзофталмия [2]. Приложена е имунизация чрез ваксинация [3], но се препоръчват отделни и допълващи се подходи, за да се получи успешно и рентабилно производството на европейски лаврак. В действителност, формулирането на рибни фуражи трябва да се занимава и с други въпроси, касаещи хуманното отношение и здравето на рибите, освен насърчаване на оптималния растеж. Допълването на рибните диети с ключови съставки е стратегия, често използвана в аквакултурата за подобряване на избрана черта. Такива диети (функционални диети) могат също да се използват за подобряване на защитата на рибите и по този начин да се избегне висока смъртност по време на вирусен или бактериален епизод на нахлуване. Витамините, пребиотиците, пробиотиците и пигментите като ксантофили и астаксантини са използвани като добавки към тези диети [4–6]. Съвсем наскоро аминокиселините (АА) се използват в проучвания на имуномодулацията [7–9], но такива познания все още са оскъдни.

Въпреки че сме наясно с голямото значение на аргинина като съществен компонент за растежа, би било от голям интерес да се определят напълно механизмите на имуномодулация на аргинин. Следователно, това проучване има за цел да дешифрира до каква степен хранителните добавки с аргинин могат да модулират европейския имунен отговор на лаврак и устойчивостта на болести срещу Vibrio anguillarum.

Материали и методи

2.1 Диетична формулировка

Три диети на основата на растителни протеини с намалено ниво на включване на рибно брашно и разтворими рибни протеинови концентрати (12,2%) са формулирани и произведени от Sparos Lda. (Olhão, Португалия). Смес от рибено масло (6,2%): рапично масло (4,2%): палмово масло (4,2%) се използва като хранителен източник на липиди. Контролната диета (CTRL) е формулирана така, че да включва необходима концентрация на АА, отговаряща на идеалния модел, оценен за европейски лаврак [15]. Двете други диети са идентични с CTRL, но са допълнени с L-аргинин при 1% или 2% (Arg1 и Arg2, съответно) за сметка на пшеничния глутен. Основните съставки се смилат (под 250 μm) в чук с микропулверизатор (SH1; Hosokawa Micron, B.V., Doetinchem, Холандия). След това прахообразните съставки и масла се смесват според целевата формулировка в смесител за гребла (RM90; Mainca, S.L., Granollers, Испания). Всички диети са произведени чрез екструзия с контролирана температура (размери на пелетите: 1,5 и 2 mm) с помощта на екструдер с ниско срязване (P55; Italplast, S.r.l., Парма, Италия). След екструдиране, всички партиди фураж бяха изсушени в конвекционна фурна (OP 750-UF; LTE Scientifics, Oldham, UK) в продължение на 4 часа при 45 ° C. Формулировката и приблизителният състав на експерименталните диети са представени в таблица 1.

Диетите бяха анализирани за общото съдържание на аминокиселини. Диетичните проби се хидролизират в 6М HCl при 116 ° С в продължение на 2 часа в стъклени флакони, промити с азот. След това пробите бяха предварително дериватизирани с флуорен реагент на Waters AccQ (6-аминохинолил-N-хидроксисукцинимидил карбамат), използвайки метода AccQ Tag (Waters, САЩ). Анализите бяха направени чрез течна хроматография с ултрависока производителност (UPLC) в система за анализ на аминокиселини с обратна фаза на Waters, използвайки норвалин като вътрешен стандарт. По време на киселинна хидролиза аспарагинът се превръща в аспартат, а глутаминът - в глутамат, така че отчетените стойности за тези аминокиселини (Asx и Glx) представляват сумата на съответните амин и киселина. Триптофанът не е определен, тъй като е частично разрушен от киселинна хидролиза. Получените пикове бяха анализирани със софтуера EMPOWER (Waters, САЩ). АА профилът на експерименталните диети е представен в таблица 2.

Trp не е анализиран. Стойностите са средни стойности ± SD.

2.2 Риба

Всички опити бяха проведени в закрити експериментални съоръжения на Института за акустична култура Торе де ла Сал (IATS-CSIC, Кастелон, Испания). Неваксинираните пръстени с 0,6 g първоначално телесно тегло са закупени от търговска люпилня (Grupo Tinamenor, Сантандер, Испания) и са аклиматизирани за повече от два месеца в експериментални съоръжения на IATS. През този период (март-юни 2014 г.) рибите са хранени с диета CTRL в поточна система с аерирана морска вода под естествен фотопериод (12 часа светлина/12 часа тъмнина) и температура (22,95 ° C ± 0,9) при IATS-CSIC географска ширина (40 ° 5N; 0 ° 10E). Параметрите на водата се наблюдават ежедневно с нива на кислород, винаги по-високи от 85% наситеност и неорганизиран амоняк под токсични нива (-1).

2.3 Проба за хранене и вземане на проби

2.4 Подготовка на бактериален инокулум и валидиране на дозата за предизвикване

Vibrio anguillarum серотип O1 (щам Lab 1), изолиран от болен европейски лаврак, се култивира в триптичен соев агар (TSA, Pronadisa, Мадрид, Испания), допълнен с NaCl в крайна концентрация 1% (TSA-1) при 24 ° C за 24 часа.

Осем различни дози бяха тествани в експеримент преди предизвикване, за да се потвърди подходяща инфекциозна доза за бактериалното предизвикателство. Юношеският европейски лаврак, държан в резервоари от 90 l при средна температура 22,3 ° C, беше инжектиран интракоеломично (ic) с 0,1 ml бактериални суспензии във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS, pH 7,4), вариращ от 4,7 × 10 3 до 1 × 10 6 единици за образуване на колонии (CFU) ml -1 (8–10 риби/доза) [16]. Отрицателната контролна риба получава 0,1 ml PBS. Смъртността се наблюдава в продължение на 8 дни и се разглежда поради V. anguillarum само ако инокулираната бактерия се възстанови в чиста култура от вътрешните органи. Проби от бъбреци и черен дроб, събрани от умираща риба, бяха директно нанесени върху плочи TSA-1. За идентифициране на патогена се използва тест за плъзгаща аглутинация със съответната антиплазма. Дозата, предизвикваща смъртност между 40 и 50% (LD40-50), е избрана за бактериалните предизвикателства.

2.5 Бактериално предизвикателство

В края на първия период на хранене (15 дни), 40 риби на диетично лечение се анестезират леко с карамфилово масло (1: 10 000), предизвиква се ic с предварително определената доза V. anguillarum и се разпределят в трикратни резервоари от 90 l (n = 10). Група от 10 риби на диетично лечение е инжектирана с PBS, като контрол на експерименталното боравене. Рибите са хранени със същите диети през периода след предизвикателството. Второто бактериално предизвикване се извършва 29 дни след началото на изпитването за хранене, следвайки същата процедура, както при първото предизвикателство. И при двете предизвикателства смъртността се наблюдаваше ежедневно (на всеки два часа), докато не се наблюдаваха повече смъртности в продължение на минимум два последователни дни, така че изпитването беше прекратено 8 дни след предизвикателството. Рибите, показващи признаци на заболяване (риби близо до водната повърхност, бавно плуващи около въздушния камък или неподвижни в дъното на резервоара), са били жертвани хуманно чрез прекомерно излагане на упойката, както беше споменато по-горе. Изследването след смъртта е извършено, както е описано по-горе.

2.6 Респираторен взрив на циркулиращи левкоцити

Респираторният взрив се оценява в циркулиращи левкоцити в края на всеки период на хранене, следвайки метода, описан от Nikoskelainen et al. [17]. Накратко, 4 μl прясна кръв се добавят към 96 μl HBSS (балансиран солев разтвор на Hanks, рН 7,4) в бяла плоска дъно с 96 ямки и се инкубират със 100 μl прясно приготвена луминолова суспензия (2 mM луминол в 0,2 М боратен буфер рН 9,0, с 2 μg ml -1 PMA) за 1 h при 24-25 ° C. Всяка проба се пуска в два екземпляра и се чете върху празно място, в което не се добавя кръв. Усилената с луминол хемилуминесценция се измерва на всеки 3 минути в плоча за четене на луминесценция (TECAN) за генериране на кинетични криви. Всяка проба се пуска в два екземпляра и се изчислява интегралната луминесценция в относителни светлинни единици (RLU).

2.7 Вродени хуморални параметри

Плазмената бактерицидна активност е измерена съгласно Graham et al. [18] с някои модификации [19]. Суспензия от Photobacterium damselae subsp. piscicida (20 μl, 1 × 10 6 CFU ml -1) се добавя към 20 μl плазма в дублирани ямки на U-образна 96-ямкова плака. HBSS беше добавен вместо плазма, за да служи като положителен контрол. След инкубационен период от 2,5 часа при 25 ° С, към всяка ямка бяха добавени 25 μl 3- (4,5 диметил-2-ил) -2,5-дифенил тетразолиев бромид (1 mg ml -1, Sigma) и плаките се инкубират в продължение на повече от 10 минути при 25 ° С. След това се добавят 200 μl диметил сулфоксид (Sigma) след центрофугиране при 2000 х g за 10 минути. Абсорбцията на образувания, ресуспендиран формазан се отчита при 560 nm в четец за микроплаки Synergy HT (Biotek). Общата бактерицидна активност се изразява като процент на убити бактерии, изчислен от разликата между пробите и положителната контрола (100% живи бактерии).

Общото съдържание на нитрити и нитрати в плазмата се измерва с помощта на колориметричен комплект нитрат/нитрит (Roche Diagnostics GmbH, Манхайм, Германия), като се адаптира към плоча с 96 ямки и следвайки инструкциите на производителя. Тъй като двете съединения са производни на ендогенно произведен NO, те са показателни за количеството NO в плазмата. Накратко, 100 μl плазма бяха добавени в два екземпляра към 50 μl редуциран никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH), последвано от добавяне на 4 μl нитрат редуктаза. Произвежда се заготовка чрез добавяне на дестилирана вода вместо плазма. Абсорбцията при 540 nm се отчита след 30 минути инкубация при 25 ° C. След това към всяка ямка се добавят 50 μl сулфаниламид и еднакъв обем N- (1-нафтил) -етилендиамин дихидрохлорид. Сместа се оставя да престои при 25 ° С в продължение на 15 минути и абсорбцията се отчита при 540 nm. Общите нива на нитрити са изчислени от предварително подготвена стандартна крива на натриев нитрит.

2.8 Анализ на генната експресия

Програмата, използвана за PCR амплификация, включва начален етап на денатурация при 95 ° C за 3 минути, последван от 40 цикъла на денатурация за 15 s при 95 ° C и отгряване/удължаване за 60 s при 60 ° C. Ефективността на PCR реакциите винаги е била по-висока от 90% и за всеки набор от праймери рутинно се извършват отрицателни контроли без шаблони за проби. Специфичността на реакциите се проверява чрез анализ на кривите на топене (скорости на нарастване от 0,5 ° C/10 s при температурен диапазон от 55–95 ° C) и линейност на серийните разреждания на реакциите на RT. Данните за флуоресценцията, получени по време на фазата на удължаване на PCR, бяха нормализирани, използвайки метода делта-делта Ct (Livak и Schmittgen, 2001). Act-Актинът е тестван за стабилност на генната експресия с помощта на софтуера GeNorm (M резултат = 0,21) и е използван като домакински ген в процедурата за нормализиране. Изчисленията с промяна на сгъването бяха направени по отношение на експресионното съотношение между Arg1 или Arg2 и CTRL риби (стойности> 1 показват нагоре регулирани гени в риби Arg1 или Arg2; стойности дни след хранене с три различни диети.

Стойностите са средни стойности ± SEM (n = 10)

3.2 Бактериално предизвикателство

Смъртността започва два дни след бактериално предизвикателство, независимо от диетичното лечение или времето за хранене (Фиг. 1а и 1б). Не се наблюдава смъртност при риби, инжектирани с PBS (данните не са показани). По отношение на първото предизвикателство (ден 15 от изпитването за хранене), инфекциозната доза, която се основава на проучването преди предизвикване, беше около 1,5 × 104 CFU ml -1. Най-високият брой на смъртните случаи се наблюдава в диетичните групи Arg1 и Arg2 със съответно 86,7% и 93,3% от смъртността (Фиг. 1а). Високата смъртност, макар и по-ниска, е регистрирана в групата CTRL (76,7%). Тъй като смъртността е била по-висока от очакваната в групата CTRL (вероятно поради повишаване на средната температура на водата - от начална температура 22,3 ° C до крайна температура 23,6 ° C), е използвана по-ниска доза за второто бактериално предизвикателство (ден 29 от храненето) ). Рибите се инжектират с 3 × 10 3 CFU ml -1 и смъртността е по-ниска, отколкото при първото предизвикателство (Фигура 1b). Рибите, хранени с диети Arg1 и Arg2, са по-податливи на инфекцията в сравнение с тези, хранени с диета CTRL, показващи смъртност съответно 67,5%, 77,5% и 52,5%.

Стойностите са средства на трикратни резервоари (n = 30). SEM и бутафорно инжектираните риби не са представени за яснота на графиките.

3.3 Респираторен взрив на циркулиращи левкоцити

Диетичният аргинин значително намалява дихателния взрив на циркулиращите левкоцити, независимо от нивото на добавка, когато рибите са били хранени в продължение на 29 дни (Фигура 2). Освен това отговорът на рибите, хранени с диетата Arg2, също е по-нисък, когато се хранят само 15 дни. Взаимодействие между времето и диетичното лечение също се наблюдава при риби, хранени с диети Arg1 и Arg2, в сравнение с лица, хранени с диета CTRL на 29 ден.

Стойностите представляват средните стойности ± SEM на относителните светлинни единици (n = 6). Различните главни букви означават статистически значими разлики между диетите, независимо от времето за хранене. Различните малки букви означават статистически значими разлики между диетите в рамките на едно и също време на хранене (двупосочна ANOVA; P Фиг. 3. Бактерицидна активност (а) и съдържание на азотен оксид (б) в плазмата на европейски лаврак, хранени с различни диети за 15 ( черни колони) или 29 (сиви колони) дни.

Стойностите представляват средни стойности ± SEM (n = 6). Звездичките означават разликите, свързани с времето за хранене във всяка диета. Различните главни букви означават статистически значими разлики между диетите, независимо от времето за хранене (Двупосочен ANOVA; P Фиг. 4. Количествена експресия на имунни гени в далака (а), предната (б) и задната (в) червата на Европейско море бас хранени различни диети в продължение на 29 дни.