Резюме

Обективен

Диаричните заболявания са водеща причина за заболеваемост и смъртност в световен мащаб, но етиологията на диарията и връзката й с хранителните резултати в ограничени ресурси е слабо дефинирана. Опитахме се да определим етиологията на придобити в общността диарии при танзанийски бебета и да оценим връзката с антропометрията и новите чревни биомаркери.

чревни

Методи

Избрана е удобна проба от кърмачета в опит с добавки на цинк и/или мултивитамини в Танзания. Субектите са записани на възраст 6 седмици и са проследени в продължение на 18 месеца. Проби от изпражнения са получени от деца с остра диария. Нов, базиран на PCR масив TaqMan е използван за скрининг на изпражненията за 15 ентеропатогени. На подгрупа субекти са измерени серумни стомашно-чревни биомаркери.

Резултати

Записани са 123 пациенти с диария. Средната ± SD възраст при вземане на проби от изпражненията е 12,4 ± 3,9 месеца. Тридесет и пет ентеропатогени са идентифицирани при 34 (27,6%) субекта: 11 ротавируса, 9 Cryptosporidium spp, 7 Shigella spp, 3 Campylobacter jejuni/coli, 3 ST-ентеротоксигенни Е. coli и 2 ентеропатогенни Е. coli. Субектите с който и да е идентифициран ентеропатоген са имали значително по-ниски z-резултати за тегло по дължина (-0,55 ± 1,10 срещу 0,03 ± 1,30, p = 0,03) при последното посещение в клиниката, в сравнение с тези без идентифициран патоген. Петдесет от 123 субекта (40,7%) са анализирали серум за антитела към LPS и флагелин. Субектите с който и да е идентифициран ентеропатоген са имали по-ниски IgA антитела срещу LPS (0.75 ± 0.27 срещу 1.13 ± 0.77, p = 0.01) и флагелин (0.52 ± 0.16 срещу 0.73 ± 0.47, p = 0.02), в сравнение с тези без идентифициран патоген.

Заключение

Този количествен PCR метод може да позволи идентифициране на ентеропатогени, които излагат децата на по-висок риск от неоптимален растеж. IgA анти-LPS и флагелиновите антитела обещават като нововъзникващи чревни биомаркери.

Въведение

Диарията продължава да бъде водеща причина за заболеваемост и смъртност при децата по света. През 2011 г. приблизително 700 000 детски смъртни случая са причинени от диария, като 72% от тези смъртни случаи настъпват при деца на възраст под две години (1). Диарията и хранителният статус са тясно взаимосвързани, тъй като недохранването увеличава податливостта към инфекции, причиняващи диария (2), а детската диария предразполага към забавяне на растежа. Смята се, че всеки епизод на диария преди навършване на 2 години увеличава риска от закъснение на детето с 5% (3). Патологичните механизми, свързващи диарията и недохранването, са сложни, но вероятно включват промени в имунната функция, повишена чревна пропускливост, нарушена абсорбция на хранителни вещества и многократно излагане на множество ентеропатогени (4).

Съществена стъпка за намаляване на заболеваемостта от диария е идентифицирането на причинителите на инфекциозни патогени, но традиционните методи за диагностика, включително бактериална култура, микроскопия на изпражненията и тестове, базирани на антиген, имат слаба чувствителност (5, 6). Наскоро бяха разработени по-нови методи, базирани на полимеразна верижна реакция (PCR) за откриване на ентеропатогени, причиняващи диария (7), но могат да открият патогени, които не причиняват клинични симптоми на диария. Например, в надлъжно проучване, което сравнява диарийните проби с контролите преди диарията, PCR анализът на изпражненията показва корелация с диария поради ротавирус, астровирус и шигела/ентероинвазивна ешерихия коли само когато данните са анализирани количествено (8). По същия начин, проучване на ентеропатогени при случаи на диария и недиарични контроли установи високи нива на откриване дори при асимптоматични контроли; специфичността се подобри, когато беше оценено количеството на патогена (9). По този начин изчисляването и интерпретацията на патогенната тежест е от решаващо значение за полезността на тези PCR методи.

В ограничени ресурси, ентеропатогените, причиняващи диария, са най-често описани при хоспитализирани деца с остра/персистираща тежка диария (10, 11). При хоспитализирани деца под 5 години в Дар ес Салаам, Танзания, диаригенна Е. coli е установена чрез стандартна бактериологична култура (12) при 22,9% от пациентите (13). Въпреки това етиологията на по-честата амбулаторна диария в Танзания остава слабо докладвана. Опитахме се да определим етиологията на придобити в общността диарии при бебета и малки деца в Танзания и предположихме, че идентифицируемите диарийни инфекции биха корелирали с висока патогенна тежест и изложили децата на риск от неоптимален растеж. Освен това оценихме връзката на нови биомаркери на стомашно-чревната функция с резултатите в тази кохорта.

Методи

Удобна извадка от кърмачета е избрана от проспективно рандомизирано проучване на ежедневни добавки с цинк и/или мултивитамини в Дар ес Салаам, Танзания (14, 15) (идентификатор Clinicaltrials.gov> NCT00421668). Съгласни майки, за които е потвърдено, че са ХИВ-отрицателни, са включени в проучването и техните бебета са рандомизирани между 5-7-седмична възраст. Изключени са бебета с много раждания и деца с вродени аномалии или други състояния, които биха повлияли на процедурите на изследване. Бебетата са били записани на 6-седмична възраст и проследявани в продължение на 18 месеца. Демографските данни бяха събрани при записване, а данните за заболеваемостта и антропометричните данни бяха събрани при последващи посещения на амбулаторни месеци. Всички деца получават периодична доза витамин А на всеки 6 месеца според стандартните грижи в Танзания.

Майките бяха помолени да се връщат в клиничната клиника с техните бебета на всеки четири седмици за събиране на данни и стандартни клинични грижи, включително мониторинг на растежа, имунизации и рутинно медицинско лечение за заболявания. По време на тези посещения медицински сестри интервюираха гледачи за историята на заболеваемостта на детето и измерваха теглото на детето на цифров вез за новородени с точност 10 g (Tanita) и дължина с точност 1 mm, използвайки дъска с твърда дължина с подвижно парче крак.

Взети са проби от изпражнения между януари 2009 г. и януари 2011 г. от деца с остра диария, определени като три или повече воднисти изпражнения за период от 24 часа. Изпражненията от деца с диария се събират на мястото на изследване чрез фекален тампон или от памперса (салфетка), или от контейнера за събиране (гърне) и се поставят във флакони, съдържащи транспортна среда. Флаконите се поставят в охладител и се транспортират ежедневно до централната лаборатория, където незабавно се замразяват при -80 ° C. Кръвта се взема от бебета на 6-седмична и 6-месечна възраст и замразява при -80 ° C.

Метод на TaqMan, базиран на PCR, е използван за скрининг на проби от изпражнения за 15 ентеропатогени. По-рано описаните патоген-специфични прекъсвания на цикъла на количествено определяне (Cq) бяха използвани за определяне на положителни резултати от PCR на изпражненията (7). Основният резултат е разпространението на всеки идентифицируем ентеропатоген на изпражненията. Вторичните резултати включват Z резултат за тегло за възрастта (WAZ), Z резултат за дължина за възраст (LAZ) и Z резултат за тегло за дължина (WLZ, измерено чрез стандартни антропометрични измервания) и чревни биомаркери (включително антитела към LPS и флагелин и аминокиселината цитрулин).

Нивата на IgA и IgG, специфични за флагелин и LPS, се определят количествено чрез ELISA, както е съобщено по-рано (16). Микротитърните плаки се покриват цяла нощ с пречистен флагелин на Е. coli (100 ng/гнездо) или пречистен LPS на Е. coli (2 µg/гнездо). Серумните проби от изследваните субекти, разредени 1: 200, се прилагат върху ямки, покрити с флагелин или LPS. След инкубация и измиване, ямките се инкубират или с античовешки IgA (KPL), или IgG (GE Healthcare), свързани с хрянова пероксидаза. Количественото определяне на общите имуноглобулини се извършва с помощта на колориметричния пероксидазен субстрат тетраметилбензидин и оптичната плътност (OD) се отчита при 450 nm с ELISA четец за плаки. Данните се отчитат като OD, коригирана чрез изваждане на фона (определя се чрез показания в проби, в които липсва серум).

Ниско концентрацията на цитрулин (CIT) в серумни проби беше оценена в лабораторията за клинични и епидемиологични изследвания в Катедрата по лабораторна медицина, Бостънска детска болница. Пробите бяха ултрацентрифугирани за отстраняване на високомолекулни протеини. Селективността на разделяне на CIT се получава, като се използва колона C18 BEH и йоно-сдвояващ агент пентадекафлуорооктанова киселина върху Waters Acquity UPLC система (Waters Corporation, Milford, MA). Положителната електроспрей йонизация и премиерният троен квадруполен масспектрометър Waters Quattro бяха използвани за откриване на CIT чрез неговите характерни преходи 176–170 и 176–113 m/z.

Данните бяха въведени двойно с помощта на софтуера Microsoft Access на централния сайт за проучване, след това конвертирани в набори от данни на SAS и качени на защитен сървър, базиран на UNIX, за анализ. Използвани са T-тестове за сравняване на средните антропометрични мерки, концентрациите на цитрулин, флагелин и LPS на 6 седмици, 6 месеца и 12 месеца при деца, които са имали положителни резултати за който и да е патоген спрямо тези, които са тествали отрицателно за всички патогени. T-тестовете използваха обединения метод, когато отклоненията са равни, и метода на Satterthwaite, когато отклоненията са неравномерни. Изграден е разпръснат график, за да се оцени връзката между ентеропатогенната тежест (измерена чрез PCR количествен цикъл за определяне, Cq) и антропометричните резултати. Всички анализи бяха извършени с помощта на софтуера SAS (версия 9.2; SAS Institute). Институционално одобрение бе дадено от Комитета по човешки субекти в Харвардското училище за обществено здраве, Комитета по изследвания и публикации на Университета по здравеопазване Muhimbili и Съюзната наука и Танзанийския национален институт за медицински изследвания.

Резултати

Бяха записани сто двадесет и три пациенти с диария. В таблица 1 са изброени изходните характеристики на популацията в проучването, включително демографски и хранителен статус на майките и бебетата. 87 (70,7%) от майките са били бременни поне веднъж преди това. 120 (97,6%) от кърмачетата са имали тегло при раждане> 2500 грама, а 8 (6,5%) са родени преди 37 гестационна възраст.

маса 1

Изходни характеристики на n = 123 пациенти с диария