Субекти

Резюме

Стимулирането на термогенните пътища изглежда обещаващ подход за намиране на нови начини за справяне с метаболитни заболявания като затлъстяване и захарен диабет тип 2. Термогенните, намаляващи теглото и сенсибилизиращи инсулина ефекти на фосфодиестераза 5 (PDE 5) инхибитори наскоро бяха постулирани, което предполага, че модулаторите на ендогенното cGMP сигнализиране имат терапевтичен потенциал за лечение на метаболитни нарушения. Повечето проучвания обаче са извършени инвитро или при животни, които не са имали непоносимост към глюкоза. По този начин ние имахме за цел да тестваме метаболитните ефекти на PDE 5 инхибитора силденафил чрез лечение на индуцирани от диета затлъстели (DIO) мишки през устата в продължение на 8 дни. Изненадващо, нашите резултати не разкриха промени в телесната температура, термогенезата на кафявата мастна тъкан (BAT) и експресията на гените в BAT и ингвиналната бяла мастна тъкан (iWAT), като по този начин се изключва термогенен или „потъмняващ“ ефект на силденафил при съществуващото затлъстяване. За разлика от това, лекуваните със силденафил DIO мишки показват промени в чернодробния метаболизъм и глюкозната хомеостаза, водещи до нарушен глюкозен толеранс (P

Въведение

Напоследък кафявата мастна тъкан (НДНТ) често се постулира като нова цел в борбата срещу затлъстяването и диабета при хората 1, тъй като е способна да изгаря големи количества триглицериди и да освобождава получената енергия под формата на топлина 2. Тъй като възрастните хора притежават само малки количества кафяви адипоцити в надключичната област, се появява откриването на сигнални пътища, които водят до индуциране на кафявоподобни (бежови/наситени) адипоцити в бялата мастна тъкан (WAT) - така нареченото „покафеняване“. да бъде отличителен белег в терапията срещу затлъстяването 3. Все още обаче липсват убедителни доказателства, че индуцирането на кафявоподобни адипоцити значително подобрява енергийните разходи на цялото тяло при мишки или хора 4 .

Активирането на оста NO/cGMP е от съществено значение за развитието на кафявите адипоцити и функцията 5 и наскоро беше доказано, че предизвиква покафеняване на ингвиналната WAT (iWAT) при мишки 6. Съответно, фармакотерапията, която повишава нивата на cGMP при затлъстяване, може да бъде обещаващ терапевтичен подход. Силденафил е инхибитор на фосфодиестераза 5 (PDE 5), който повишава нивата на cGMP и се използва широко за лечение на белодробна артериална хипертония (PAH) и еректилна дисфункция (ED), особено при диабетна невропатия, срещаща се често при затлъстяване 7,8. Следователно, първоначални проучвания инвитро, при слаби животни, както и при хора преди диабет, предполага, че силденафил може да има благоприятни метаболитни ефекти чрез „покафеняване“ на iWAT 6,9. Въпреки това, малко се знае за ефектите на силденафил в състояние на непоносимост към глюкоза. По този начин нашето проучване има за цел да изследва последиците от лечението със силденафил върху термогенезата и хомеостазата на глюкозата при индуцирани от диета затлъстели мишки (DIO) с фокус върху възможното участие на кафяви/кафяви адипоцити.

Материали и методи

Животновъдство

Проведени са експерименти върху мъжки мишки от див тип C57BL/6NCr (река Чарлз, Германия) на възраст 3-5 месеца (н = 8 независими животни на група). Мишките бяха настанени в групи от по 4 животни при температура на околната среда 22 ± 1 ° С, при постоянен 12-часов цикъл светлина/тъмнина и бяха хранени ad libitum. Всички процедури за животни са одобрени от MELUR Schleswig-Holstein, Германия.

Експериментална настройка

Започвайки на възраст от 12 седмици, животните са били хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD, 60% мазнини, DC 12492, Research Diets, САЩ). След 6 седмици на HFD е извършен първият метаболитен анализ, който включва тест за толерантност към глюкоза (GTT, 1,5 g/kg телесно тегло ip), инфрачервена термография (T335, FLIR, Швеция) и ректална термометрия (BAT-12, Physitemp, САЩ). След 1 седмица на възстановяване животните бяха разпределени на случаен принцип за контрол (н = 8) или силденафил (н = 8) група. Групата със силденафил се третира орално с 400 µg/ml силденафил цитрат (Stada®), разтворен в подкиселена чешмяна вода (рН 3.0), докато контролната група получава само подкиселена чешмяна вода 10. Ежедневно се измерва телесното тегло, храната и приема на вода. Дневният прием на вода на мишка е бил 2,87 ml ± 0,13 ml, което се равнява на поглъщане на 1,15 mg силденафил на ден и мишка. Въз основа на средното телесно тегло на мишки, третирани със силденафил от 43,3 ± 2,5 g, дневната доза на силденафил се екстраполира до 26,6 mg/kg. Инфрачервените снимки са направени на 5-ия ден на лечението и GTT се повтаря на 6-ия ден на лечението. След 2 дни възстановяване животните са умъртвени и пробите кръв и органи са събрани.

Количествена PCR в реално време (qPCR)

Изолацията на РНК и количествената PCR в реално време на черния дроб, iBAT, iWAT и епидидималната WAT (eWAT) бяха извършени, както е описано по-горе 11 .

ИФА/ОВОС

Серумният C-пептид 2 (EZRMCP2-21K, Millipore, Германия) и съдържанието на cGMP в черния дроб (RPN226, GE Healthcare, UK) бяха измерени с помощта на търговски комплекти в съответствие с инструкциите на производителя.

Съдържание на гликоген и ензимна активност

Съдържанието на гликоген, PEPCK и PK ензимната активност на бързо замразени чернодробни тъканни проби бяха определени, както е описано по-рано 12 .

Хистология

Оцветяването с хематоксилин и еозин се извършва върху 5 µM парафинови чернодробни секции съгласно инструкциите на производителя (разтвор за бързо оцветяване H&E, Carl Roth, Германия).

Статистически анализ

За анализ на данните е използван софтуер GraphPad Prism 6. Различията между групите бяха сходни и бяха проведени подходящи тестове за анализ на статистическите разлики между контролните и лекуваните със силденафил групи, както е посочено в текстовите и фигуралните легенди. Стойностите са представени като средна стойност ± s.e.m.

Резултати

Метаболитни и термогенни ефекти на лечението със силденафил

Инхибирането на PDE 5 чрез перорално лечение със силденафил доведе до 1,96-кратно повишаване на чернодробните нива на cGMP при DIO мишки (фиг. 1а), потвърждавайки ефикасността на лечението. Това обаче не повлиява наддаването на тегло при съществуващото затлъстяване, което води до сходни телесни тегла на лекувани със силденафил и контролни животни в деня на жертвата (ден на лечение 8, фиг. 1б). В допълнение, чернодробното тегло, както и теглото на органите на избрани мастни накладки, са непроменени (фиг. 1в) и приемът на храна и вода е сходен (данните не са показани).

силденафил

Въпреки че се очаква повишеното cGMP сигнализиране да доведе до активиране на НДНТ и промени в регулирането на телесната температура, ние не открихме ефект от лечението със силденафил върху телесната температура (фиг. 1г) или температурата на iBAT при DIO мишки (фиг. 1д – е). Освен това анализът на генната експресия на важни термогенни и липолитични маркери гени в iBAT не разкрива промени в термогенния профил на кафявите адипоцити (фиг. 1g). Дори по-важното е, че силденафил не предизвиква покафеняване на WAT, както е показано чрез анализ на генната експресия на маркерите за покафеняване в iWAT (фиг. 1h). Експресията на моноцитен хемоаттрактант протеин-1 (Mcp-1), хемокин, който служи като маркер за свързано със затлъстяването възпаление, е непроменен в iBAT, леко повишен в iWAT и значително понижен в eWAT на животни, лекувани със силденафил (P = 0,0406, фиг. 1g-i).

Ефекти от лечението със силденафил върху метаболизма в черния дроб и хомеостазата на глюкозата

Тествахме последиците от повишеното cGMP сигнализиране върху метаболизма в черния дроб (Фиг. 2а), разкривайки, че лечението със силденафил не води до промени в генната експресия на ограничаващи скоростта ензими на гликолиза, глюконеогенеза или метаболизъм на мастни киселини. Анализите на ензимната активност обаче показват, че лечението със силденафил предизвиква преминаване от чернодробна глюконеогенеза към гликолиза, както е показано от значително по-висока активност на чернодробната пируват киназа (ПК, P = 0,0021, фиг. 2г – д) и значително по-ниско съотношение PEPCK/PK при третирани със силденафил DIO мишки (P = 0,0106, фиг. 2е). Увеличението на PK активността обаче не е повлияло на съдържанието на чернодробен гликоген и морфологията на черния дроб е непроменена (Фиг. 2b – c).

Въпреки че предишни проучвания съобщават за благоприятни ефекти от повишените нива на cGMP върху инсулиновата сигнализация in vivo 9,13, при нашите DIO мишки наблюдаваме намаляване на глюкозния толеранс при мишки след краткотрайно лечение със силденафил (Фиг. 2h – k). Докато глюкозният толеранс на контролните мишки не се променя между ден 0 и ден 6 (средна AUC на контролната група, ден 0 = 75,6 ± 3,6, ден 6 = 72,7 ± 3,1, сдвоени т-тест, P = 0,5157), глюкозният толеранс при мишки, лекувани със силденафил, е значително нарушен след 6 дни (средна AUC на групата със силденафил, ден 0 = 77,7 ± 5,4, ден 6 = 87,7 ± 5,9, сдвоени т-тест, P = 0,0344). Непроменените серумни нива на С-пептид 2 сочат към увреждания в инсулиновата чувствителност, като например промени в усвояването на глюкозата в скелетните мускули, а не промени в секрецията на инсулин (Фиг. 2ж).

Дискусия

Препратки

Cypess, A. M. & Kahn, C. R. Кафява мазнина като терапия за затлъстяване и диабет. Curr. Становище. Ендокринол. Диабет затлъстявания. 17, 143–149 (2010).

Cannon, B. & Nedergaard, J. Brown мастна тъкан: функция и физиологично значение. Физиол. Преп. 84, 277–359 (2004).

Petrovic, N. et al. Активирането на хроничен пероксизомен пролифератор гама (PPARgamma) активиране на епидидимно получени бели адипоцитни култури разкрива популация от термогенно компетентни, съдържащи UCP1 адипоцити, молекулярно различни от класическите кафяви адипоцити. J. Biol. Chem. 285, 7153–7164 (2010).

Warner, A. & Mittag, J. Breaking BAT: може ли кафявото създаване на по-добро бяло? J. Ендокринол. 228, R19 – R29 (2016).

Pfeifer, A., Kilic, A. & Hoffmann, L. S. Регулиране на метаболизма чрез cGMP. Pharmacol. Тер. 140, 81–91 (2013).

Mitschke, М. М. и сътр. Увеличеният cGMP насърчава здравословното разширяване и покафеняване на бялата мастна тъкан. FASEB J. 27, 1621–1630 (2013).

El-Sakka, A. I. Ефикасност на силденафил цитрат при лечение на еректилна дисфункция: ефект на диабет тип 2. Евро. Урол. 46, 503–509 (2004).

Galie, N. et al. Терапия със силденафил цитрат за белодробна артериална хипертония. N. Engl. J. Med 353, 2148–2157 (2005).

Ramirez, C. E. et al. Лечението със силденафил подобрява инсулиновата чувствителност при преддиабет: рандомизирано, контролирано проучване. J. Clin. Ендокринол. Metab. 100, 4533–4540 (2015).

Adamo, C. M. et al. Силденафил обръща сърдечната дисфункция в MDX миши модел на мускулна дистрофия на Дюшен. Proc. Natl Акад. Sci. САЩ 107, 19079–19083 (2010).

Oelkrug R., et al. Нанизъм и инсулинова резистентност при мъжкото потомство, причинени от α1-адренергичен антагонизъм по време на бременност. Мол Метаб. 6, 1126–1136 (2017).

Vujovic, M. et al. Интерференция на мутантния рецептор на тиреоиден хормон алфа1 с метаболизма на чернодробната глюкоза. Ендокринология 150, 2940–2947 (2009).

Ayala, J. E. et al. Хроничното лечение със силденафил подобрява енергийния баланс и инсулиновото действие при съзнателни мишки с високо съдържание на мазнини. Диабет 56, 1025–1033 (2007).

Laakso, M., Edelman, S. V., Brechtel, G. & Baron, A. D. Намален ефект на инсулина за стимулиране на кръвния поток от скелетни мускули при затлъстел човек. Нов механизъм за инсулинова резистентност. J. Clin. Инвестирам 85, 1844–1852 (1990).

Roy, D., Perreault, M. & Marette, A. Инсулиновата стимулация на усвояването на глюкоза в скелетните мускули и мастните тъкани in vivo НЕ зависи. Am. J. Physiol. 274, E692 – E699 (1998).

Behr-Roussel, D. et al. Ежедневното лечение със силденафил обръща ендотелната дисфункция и оксидативен стрес при животински модел на инсулинова резистентност. Евро. Урол. 53, 1272–1280 (2008).

Hill, K. D., Eckhauser, A. W., Marney, A. & Brown, N. J. Инхибирането на фосфодиестераза 5 подобрява бета-клетъчната функция при метаболитен синдром. Грижа за диабета 32, 857–859 (2009).

Ho, J.E. et al. Ефект на инхибирането на фосфодиестеразата върху инсулиновата резистентност при индивиди със затлъстяване. J. Am. Сърдечен доц. 3, e001001 (2014).

Walker, D. K. et al. Фармакокинетика и метаболизъм на силденафил при мишки, плъхове, зайци, кучета и хора. Xenobiotica 29, 297–310 (1999).

Bartelt, A. & Heeren, J. Зачервяване на мастната тъкан и метаболитно здраве. Нат. Преподобен Ендокринол. 10, 24–36 (2014).

Rao, T. S. S., Kumar, V. A., Raman, R. & Andrade, C. Продължителна, продължителна, злоупотреба със свръхвисоки дози на силденафил. Индийски J. Psychiat 57, 311–312 (2015).

Благодарности

Благодарим на Джулия Реш и персонала на GTH за животни за техническа помощ. Това проучване е финансирано от Deutsche Forschungsgemeinschaft (Heisenberg Programm MI1242/2-1, MI1242/3-1; SPP1629 „Thyroid TransAct“ MI1242/4-1 & 6-1 to JM). K.J., S.G., L.H. и B.H. са ученици на GRK1957 „Адипоцити-мозъчни кръстосани връзки“. Признаваме финансовата подкрепа от Land Schleswig-Holstein в рамките на програмата за финансиране Open Access Publikationsfonds.

Информация за автора

Принадлежности

Катедра по вътрешни болести I, Група по молекулярна ендокринология, Университет в Любек, Ratzeburger Allee 160, 23562, Любек, Германия

Корнелия Йохан, Марлен Колийн Рейс, Лисбет Хардър, Бийт Херман, Согол Гачкар, Йенс Митаг и Ребека Оелкруг

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Автора за кореспонденция

Етични декларации

Конфликт на интереси

Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси.

Допълнителна информация

Бележка на издателя: Springer Nature остава неутрален по отношение на юрисдикционните претенции в публикувани карти и институционални принадлежности.