Принадлежност Div. по гастроентерология, хепатология и хранене, катедра по вътрешни болести, Медицински факултет на Университета на Вирджиния в Британската общност, Ричмънд, Вирджиния, 23298, Съединени американски щати

чернодробния

Принадлежност Div. по гастроентерология, хепатология и хранене, катедра по вътрешни болести, Медицински факултет на Университета на Вирджиния в Британската общност, Ричмънд, Вирджиния, 23298, Съединени американски щати

Принадлежност Div. по гастроентерология, хепатология и хранене, катедра по вътрешни болести, Медицински факултет на Университета на Вирджиния в Британската общност, Ричмънд, Вирджиния, 23298, Съединени американски щати

Принадлежност Div. по гастроентерология, хепатология и хранене, катедра по вътрешни болести, Медицински факултет на Университета на Вирджиния в Британската общност, Ричмънд, Вирджиния, 23298, Съединени американски щати

Принадлежност Div. по гастроентерология, хепатология и хранене, катедра по вътрешни болести, Медицински факултет на Университета на Вирджиния в Британската общност, Ричмънд, Вирджиния, 23298, Съединени американски щати

Принадлежност Div. по гастроентерология, хепатология и хранене, катедра по вътрешни болести, Медицински факултет на Университета на Вирджиния в Британската общност, Ричмънд, Вирджиния, 23298, Съединени американски щати

Биомедицинска лаборатория за масова спектрометрия, Център за клинични изследвания, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида, Съединени американски щати

Принадлежност Div. по гастроентерология, хепатология и хранене, катедра по вътрешни болести, Медицински факултет на Университета на Вирджиния в Британската общност, Ричмънд, Вирджиния, 23298, Съединени американски щати

  • Томи Пакана,
  • Софи Казанаве,
  • Аврора Вердианели,
  • Вайшали Пател,
  • Хе-Ки Мин,
  • Фаридодин Миршахи,
  • Иоин Куинливан,
  • Арун Дж. Санял

Фигури

Резюме

Измерване на концентрациите на един въглероден метаболит

Непосредствено преди хомогенизирането към чернодробната проба (20 mg всеки) се добавя оцетна киселина (100 mmol/L), съдържаща маркираните вътрешни стандарти. Обемът на добавената вътрешна стандартна смес е равен на 10 μl на mg претеглена тъкан (200 μl на 20 mg тъкан). След това пробата се хомогенизира с помощта на пелетен пестел (Kontes).

За да се утаят протеини, 150 μl ледено студен метанол се добавя към 50 μl хомогенат. След завихряне, за да се смеси, пробата се центрофугира при 20 000 g в продължение на 5 минути. След това супернатантата се анализира чрез LC-MS/MS, използвайки Thermo-Finnigan Quantum Ultra в режим SRM. Съотношението на всеки аналит към неговия вътрешен стандарт се изчислява и концентрацията на аналита се определя чрез сравняване спрямо стандартните калибрационни криви.

Измерване на концентрациите на хомоцистеин, цистеин, глутатион и цистеинил-глицин

Общите концентрации на хомоцистеин, цистеин, глутатион и цистеинил-глицин бяха измерени след редуциране до свободни тиоли и дериватизиране чрез HPLC с флуоресцентна детекция, както е описано по-горе [28].

Измерване на концентрациите на фосфатидилетаноламин и фосфатидилхолин

Чернодробните тъканни проби се претеглят, пулверизират се със система за сухо пулверизиране CP02 CryoPrep (Covaris) и се суспендират отново в ледено студен метанол, съдържащ 0,1% бутил-хидрокси-толуен (BHT) в концентрация 100 mg/ml. Фосфолипидите бяха извлечени с помощта на модифицирана екстракция на липиди на Folch [29], извършена върху робот Hamilton Microlab Star. Пробите бяха добавени с известни количества не-ендогенни синтетични вътрешни стандарти, както е описано от Ståhlman et al. [30]. След липидна екстракция пробите се разтварят в хлороформ: метанол (1: 2, v/v). Екстрактите се съхраняват при -20 ° С преди MS анализ.

Липидните екстракти се анализират на хибриден масспектрометър с тройно квадруполно/линейно йонно улавяне (QTRAP 5500), снабден с роботизиран източник на йони в нанопоток (NanoMate HD) според Ståhlman и колеги [30]. Молекулярните липиди бяха анализирани както в положителни, така и в отрицателни йонни режими, използвайки методи за сканиране на множество прекурсорни йони (MPIS) и неутрални загуби (NL) [31, 32]. Липидите се нормализират до съответния им вътрешен стандарт и теглото на тъканите.

Определяне на процентното метилиране на дезоксицитидин

Диетата с HFHC предизвиква множество промени в цикъла на метионин

A: Изчерпване на метионин, повишено съотношение SAM/метионин, повишаване на SAH и излишък на хомоцистеин в черния дроб с HFHC диета.

Първият етап от цикъла на метионин е деметилиране на метионин към SAM чрез метионин аденозилтрансфераза (MAT). MAT е продукт на два различни гена, Mat1a и Mat2a. Първият се експресира само при възрастни хепатоцити, докато вторият се експресира както в чернодробната, така и в извънхепаталната тъкан [35]. Диетата с HFHC доведе до 30% изчерпване на метионин (p Фиг. 1. Цикъл на метионин: изчерпване на чернодробния метионин и натрупване на хомоцистеин в индуцирана от диетата NAFLD.

(A) Диетата с HFHC в продължение на 52 седмици доведе до изчерпване на метионин (мет) (p Фигура 2. Път на транссулфуриране: изчерпването на серина ограничава способността за напълване на глутатион при индуциран от диетата NAFLD.

(A) Диетата с HFHC за 52 седмици доведе само до умерено незначително увеличение на нивата на цистатионин (CST) и цистеин (Cys) въпреки натрупването на хомоцистеин и намаляването на нивата на глутатион. (B) експресията на тРНК на цистатионин β-синтаза (Cbs) и γ-глутамилцистеин синтетаза (γ-Gcs) намалява, но нивата на протеин на CBS и GCS не се променят значително. (C) Глутатионът (GSH) е изчерпан (p Фигура 3. Път на трансметилиране: отклонение в реакциите на метилтрансфераза при индуцирана от диетата NAFLD.

(А) Представяне на топлинна карта на субстрати и метилирани продукти на основните реакции на трансметилиране, получени от SAM (PEMT, GNMT, GAMT и PRMT) с HFHC диета за 52 седмици. (B) Нивата на глицин, субстрат за GNMT, бяха намалени (p Фиг. 4. Стабилно глобално ДНК метилиране и хидроксиметилиране и HMG-CoA редуктаза ДНК хиперметилиране при индуцирана от диетата NAFLD.

(A-B) Въпреки че генната експресия за Dnmt1 и Dnmt3a има тенденция да намалява и намалява, съответно, процентът на метилдезоксицитидин не се променя между чау и HFHC група. (C) Относителните концентрации от 5hmdC също не се променят. (D) Сред отделните гени, участващи в патогенезата на NAFLD, Hmgcr е хиперметилиран (p Фигура 5. Обобщение на промените в цикъла на метионина, пътя на транссулфуриране и метилтрансферазата предварително NAFLD.

Диетата с HFHC в продължение на 52 седмици води до изчерпване на метионин, излишък от хомоцистеин и отклонения в пътя на трансметилиране. Намаляването на субстратния серин нарушава реметилирането на хомоцистеина и ограничава способността за пълнене на глутатион по пътя на транссулфурирането. Легенда: цистатионин β-синтаза (CBS); диметилглицин (DMG); у-глутамилцистеин синтетаза (GCS); глутатион (GSH); 3-хидрокси-3-метилглутарил-коензим А редуктаза (HMGCR); метионин аденозилтрансфераза (MAT); фосфатидилхолин (PC); фосфатидилетаноламин (PE); протеин аргинин метитрансфера 1 (PRMT1); s-аденозилметионин (SAM); s-аденозилхомоцистеин (SAH); s-аденозилхомоцистеин хидролаза (SAHH).

Изчерпването на запасите от чернодробен метионин изглежда е зависимо от времето явление. Предишни проучвания не откриват доказателства за изчерпване на метионина след 3–12 седмици от диета с HFHC [22–25]. Съдържанието на метионин в диетата обаче не се съобщава и животните са имали само ранен стадий на заболяване със стеатоза без видима фиброза. Зависимостта от времето на наблюдаваното изчерпване на метионина въпреки адекватната диета предполага, че търсенето на метионин е функция на прогресията на заболяването. Настоящото проучване и наличната литература обаче не ни информират дали промените в метаболитните пътища на метионин отразяват адаптивна реакция за ограничаване на прогресията на заболяването или всъщност допринасят за прогресията на заболяването. Това е важно съображение, тъй като адаптивният отговор би дал основание за добавянето на метионин, докато неадаптивният отговор не би го направил. Следователно е разумно да се извършат допълнителни предклинични изпитвания на добавки с метионин, преди да се включите в мащабни изследвания върху хора.

Хиперхомоцистеинемията е тясно свързана с метаболитния синдром и е доказано, че присъства при пациенти с NAFLD [14-16]. Доказано е, че натрупването на хомоцистеин активира разгънатата чернодробна протеинова реакция и индуцира оксидативен стрес, чернодробно възпаление и фиброза [19, 20]. Хомоцистеинът е междинен продукт в метаболизма на метионин, който се осъществява главно в черния дроб [9]. Наблюдаваното изчерпване на метионин и увеличаване на SAM и SAH предполага повишено образуване на чернодробен хомоцистеин в резултат на повишена активност на трансметилиране на SAM. Важно е обаче да се отбележи, че нивата на SAH хидролаза намаляват прекомерно, което корелира с повишаването на SAH, но не и с повишаването на хомоцистеина. Това предполага, че натрупването на хомоцистеин е резултат от намалено негово използване, или от променено реметилиране до метионин и/или транссулфураща активност.

Реметилирането на хомоцистеин изисква активността на метионин синтазата и бетаин-хомоцистеин метилтрансферазата и наличието на бетаин и серин-зависима активност на фолатния цикъл [13, 37, 38]. Настоящото проучване показва, че експресията на тези ензими не се променя значително при условията на диета с HFHC. Съществува обаче изчерпване на серина, което се очаква да наруши трансфера на метилови групи от метилтетрахидрофолат [38] и да инхибира реметилирането на хомоцистеин. Намаленото съотношение на диметилглицин към бетаин също подкрепя концепцията, че нарушеното реметилиране на хомоцистеин към метионин [39] допринася за изчерпването на метионин, както и повишаването на хомоцистеина след продължително приложение на диета с HFHC и развитие на NAFLD с фиброза. Предполага се, че нарушеното реметилиране също присъства при хора с NAFLD [21].

Също така е привлекателно да се предположи, че повишеното търсене на хомоцистеин за презареждане на глутатион в условията на индуциран от диетата оксидативен стрес задвижва деметилирането на метионин и SAM и е ключов двигател за изчерпването на метионина. Ако е така, терапиите, свързани с намален оксидативен стрес и защита на запасите от глутатион, биха могли да подобрят изчерпването на метионин. Трябва да се отбележи, че при хора с NASH наблюдаваме тенденция за намаляване на нивата на циркулиращия хомоцистеин след лечение с витамин Е (непубликувани данни от метаболомични анализи на плазмени проби на субекти в проучването PIVENS) [46].

Настоящото проучване също така предоставя доказателства за отклонения в реакциите на метилтрансфераза в резултат на дългосрочна диета с HFHC. GNMT е най-разпространената метилтрансфераза в черния дроб и участва главно в чернодробния катаболизъм на SAM. При нокаутиращите мишки Gnmt SAM става повишен и води до бързо развитие на NAFLD [47]. В настоящото проучване SAM е умерено повишен въпреки намалените нива на GNMT. Възможно е SAM да се използва значително от други реакции на метилтрансфераза. Увеличение на PEMT потока като адаптивна реакция на чернодробното натрупване на SAM се наблюдава при нокаутиращи мишки GNMT [44]. Относителното увеличение на съотношението PC (продукт) към PE (субстрат) в настоящото проучване, въпреки общото изчерпване на тези фосфолипиди, предполага продължителна активност на този ензим. Изчерпването на тези фосфолипиди се наблюдава и от нашата група при човешки NAFLD [48]. По-специално намаляването на PC може потенциално да повлияе на мембранната течливост и да активира разгънатия протеинов отговор, като играе роля в патогенезата на NAFLD. Липсата на промени в нивата на холин се аргументира с увеличения синтезиран от CDP-холин PC синтез, въпреки че не може да се направи окончателно изявление за това.

Интересното е, че метилираните метаболити на аргинин (ADMA и MMA) са изчерпани от черния дроб при мишки след 52-седмичната HFHC диета. Това се случи въпреки значително увеличение на нивата на протеин на PRMT1, което се очаква да доведе до повишено образуване на тези съединения, заедно с повишени нива на ADMA в циркулация. Ние заключаваме, че това представлява засилено образуване на ADMA и MMA и износа им от хепатоцити. Важно е да се отбележи, че ADMA е добре известно, че инхибира активността на азотния оксид синтаза (NOS) и е важен модулатор на eNOS-медиирана вазодилатация [49, 50]. NAFLD се свързва с повишена iNOS активност и възпаление и iNOS нокдаунът показва, че подобрява както възпалението, така и нараняванията/апоптозата [51–54]. Изчерпването на чернодробната ADMA в това проучване осигурява потенциален механизъм за увеличения iNOS, наблюдаван от други при условия на диета с HFHC [52, 55]. Едновременно с това повишената циркулираща ADMA вероятно ще допринесе за системна ендотелна дисфункция, която често се наблюдава при NAFLD [56].

ДНК метилирането е основен епигенетичен механизъм и метилирането на дезоксицитидин в CpG острови върху промотори на гени инхибира свързването на транскрипционен фактор и по този начин по принцип инхибира генната експресия [57, 58]. Развитието на чернодробна стеатоза при миши модел е придружено от променена експресия на DNMT 1 и DNMT 3A в черния дроб [59]. В настоящото проучване, въпреки че генната експресия на Dnmt3a беше значително намалена, не наблюдавахме значителни промени в глобалния статус на метилиране при мишки, хранени с диета HFHC. Освен това индивидуалното метилиране на Fasn, Nfkb1, c-Jun, Bcl-2 и Caspase-3 бяха непроменени. Освен това индивидуалното метилиране на FAS, NFkB1, c-Jun, Bcl-2 и каспаза-3 бяха непроменени. Следователно липсва епигенетична адаптация за минимизиране на de novo липогенезата, възпалението и апоптозата при мишки с NAFLD. Единственото потенциално изключение е наблюдаваното хиперметилиране на Hmgcr, което вероятно представлява адаптивна реакция за намаляване на синтеза на холестерол в лицето на диетичното претоварване с холестерол.

В обобщение, напредналият NAFLD е свързан с множество промени в метаболизма на метионин, които водят до дефицит на чернодробен метионин и повишаване на хомоцистеина, главно в резултат на нарушено реметилиране на хомоцистеин до метионин. Докато високите нива на хомоцистеин осигуряват субстрат за презареждане с глутатион, това само по себе си може да допринесе за прогресиране на заболяването при NAFLD. Изчерпването на субстратния серин също ограничава изчерпването на запасите от глутатион в отговор на оксидативен стрес. Наблюдава се и отклонение в реакциите на метилтрансфераза, което се доказва от намаляване на Gnmt и увеличаване на съотношението PC/PE и PRMT. Намаляването на нивата на ADMA и MMA играе важна механистична роля в патогенезата на NAFLD чрез увеличаване на iNOS-медиирано възпаление и апоптоза, като по този начин прогресията на заболяването при NAFLD.

подкрепяща информация

S1 Фиг. Представителен образ на стеатоза, предизвикана от висококалорична диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 52 седмици.

Чернодробните тъкани се оцветяват с хематоксилин и еозин (HE). В полето с висока мощност макровезикуларната стеатоза и малката капчична стеатоза, която е центробуларна по разпределение, присъства в черния дроб при условия на високомаслена висококалорична диета в продължение на 52 седмици (1а).

S2 Фиг. Представителен образ на възпалението и фиброзата, предизвикани от висококалорична диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 52 седмици.

Чернодробните тъкани на мишки, хранени с високомаслена висококалорична диета в продължение на 52 седмици, се оцветяват с трихромовото оцветяване на Masson. Наблюдават се разпръснати огнища на възпалителни клетки и обширна перицелуларна фиброза, което показва напреднала форма на NAFLD.

S1 Таблица. MAT, метионин аденозилтрансфераза; Ahcy, аденозилхомоцистеиназа; Gnmt, глицин N-метилтрансфераза; Cbs, цистатионин β-синтаза; y-Gcs, y-глутамилцистеин синтетаза; Bhmt, бетаин-хомоцистеин метилтрансфераза; Ms, метионин синтаза; Prmt, протеин аргинин метилтрансфераза; Dnmt, ДНК метилтрансфераза; Gapdh, глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа.

Принос на автора

Замислил и проектирал експериментите: TP AJS EQ. Изпълнени експерименти: TP SC EQ. Анализирани данни: TP SC AV VP HM FM EQ AJS. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: TP SC AV EQ HM FM AJS. Написа хартията: TP SC AJS.

Препратки

Тематични области

За повече информация относно предметните области на PLOS кликнете тук.

Искаме вашите отзиви. Имат ли смисъл тези предметни области за тази статия? Щракнете върху целта до неправилната тема и ни уведомете. Благодаря за вашата помощ!

Е тематичната област "Метионин" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Диета" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "ДНК метилиране" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Глутатион" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Мастен черен дроб" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Метилтрансферази" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Серин" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Глицин" приложим за тази статия? да не