Свързани данни

Резюме

Ензимите на цитохром P450 монооксигеназа (P450) метаболизират критични ендогенни химикали и окисляват почти всички ксенобиотици. Дисрегулираните дейности на P450 водят до променен капацитет за метаболизъм на лекарствата и клетъчен стрес. Ефектите от смесената експозиция върху експресията и активността на P450 са променливи и неуловими. Диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) е често срещана експозиция, която води до затлъстяване и свързани патологии, включително хепатотоксичност. Тук докладваме ефектите от цигарения дим върху активността на P450 с нормално тегло и индуцирани от HFD затлъстели мишки. Резултатите от профилиране на протеини, базирани на активност, показват, че мишките с HFD са намалили значително активността на P450, вероятно предизвикана от възпалителни химикали, и че P450, участващ в детоксикацията, метаболизма на ксенобиотиците и синтеза на жлъчни киселини, се осъществява чрез взаимодействие с HFD и дим. Тютюнопушенето повишава активността на всички бели дробове P450 и едновременното излагане на диета P450 2s1. Трябва да разширим разбирането си за общите експозиции, свързани с променен метаболизъм на P450, за да подобрим безопасността и ефикасността на терапевтичното дозиране на лекарства.

Графичен резюме

високо

ВЪВЕДЕНИЕ

Световният процент на затлъстяване при възрастни се е удвоил от 1980 г. насам, като 39% от възрастните са класифицирани като наднормено тегло 1. Диета, предизвикана от затлъстяване (DIO), е придружена от хронично възпаление, оксидативен стрес и повишена чувствителност към широк спектър от съпътстващи заболявания, включително захарен диабет тип 2 (T2DM), хипертония, неалкохолно мастно чернодробно заболяване (NAFLD), заболяване на жлъчния мехур и някои видове рак 2. В сравнение с лица с нормална телесна маса, индивидите със затлъстяване също имат по-висок риск от хепатотоксичност 3, 4 и изпитват физиологични промени, които променят фармакокинетиката (PK) и фармакодинамиката (PD) на лекарствения метаболизъм 5, 6. Индуцираните от затлъстяването промени в ПК и PD са променливи и се смята, че се променят от кръвния поток, разпределението на мастната тъкан, микробиомния състав 7, 8 и функционалния статус на ензимите, метаболизиращи лекарството (DME) 9. Въпреки тези познания, препоръките за дозиране на лекарства все още се получават предимно от клинична оценка на здрави индивиди. Затлъстелите лица са силно недостатъчно представени в тези оценки, което води до лошо дефинирани и потенциално вредни режими на дозиране на наркотици за пациенти със затлъстяване 4–6, 10 .

ABPP на активност P450 поради индивидуална или съпътстваща експозиция. Мишките са били изложени на HFD и/или CSE, а черният дроб и белите дробове са събрани. Микрозомите се изолират от тъканни хомогенати и се инкубират с базирани на активност сонди (ABP). След етикетирането на P450, беше използвана химична химия за добавяне на азидо биотин и комплексите протеин-сонда-биотин бяха обогатени със стрептавидинова смола. АНР-насочени ензими бяха смилани с трипсин върху смолата и получените пептиди бяха анализирани чрез количествена LC-MS с висока разделителна способност.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ПРОЦЕДУРИ

Животни и диета.

Стандартна диета (SD) и диета с високо съдържание на мазнини (HFD), хранени с мъжки мишки C57BL/6J, са закупени от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME). В това проучване бяха включени само мъжки мишки, тъй като полът е документиран фактор, който влияе върху експресията и активността на някои P450 24 и ние избрахме да ограничим променливите, за да осигурим фокусиран обхват на изследването. Мишките бяха аклиматизирани в акредитираното от AALAS животно съоръжение, както и в носовите ограничителни тръби за една седмица преди започването на CSE. Храната и чешмяната вода се осигуряват ad libitum, с изключение на случаите, когато животните се поставят в епруветки за излагане. Всички животни са били наблюдавани два пъти дневно за смъртност и смърт. Всички процедури бяха проведени с одобрението на институционалните комитети за грижи и употреба на животните в Националната лаборатория на Тихоокеанския северозапад. SD диетите се състоят от сертифицирана от PMI® 5002 диета за гризачи (PMI 5002 Diet Diet®, Richmond, IN;

13 kcal% мазнини) HFD са D12492 Diet Diet Diet (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ; 60 kcal% мазнини), започвайки на шестседмична възраст и продължават през цялото проучване. HFD мишките са били хранени с тази диета в продължение на девет седмици преди началото на двуседмичния режим на CSE, което е довело до значително увеличение на телесното тегло в сравнение със SD животни за същия период от време (Фигура 2).

Средно телесно тегло (А), и средна серумна глюкоза (Б) при аутопсия (± SE, n = 8). След 11 седмици на SD или HFD, мишките на HFD се увеличиха значително (р 14. Концентрацията на дим (μg WTPM/L) беше определена гравиметрично от дублирани филтърни проби, събрани през 1-ви, 3-ти и 5-ия час от 5-часов период на излагане. Пробите от дим се събират на 47 мм филтри от стъклени влакна в стил Кеймбридж и средната концентрация на излагане се изчислява от масата, събрана върху филтъра, и общия обем въздух, изтеглен през филтъра, както се определя от времето за вземане на пробата и дебит.

Определяне на концентрацията на карбоксихемоглобин.

Веднага след последното излагане, животните бяха упоени (изофлуран) и кръв, събрана от орбиталния синус за определяне на карбоксихемоглобин (COHb) с помощта на OSM3 хемоксиметър (Radiometer, Копенхаген, Дания). Животните бяха отстранени от експозиционната единица и събирането на кръв беше започнато в рамките на

5 минути. Кръвните проби се събират в епруветки, съдържащи калиев EDTA) и се поставят в ледена баня, докато се анализират.

Събиране на тъкани.

В деня след последното излагане мишките бяха евтаназирани с пентобарбитал и обезкървени. Черният дроб и белите дробове от всяка мишка бяха събрани и замразени и съхранени при -80 ° C.

Измерване на серумна глюкоза.

Комплект за калориметричен анализ на глюкоза (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MA) беше използван според указанията на производителя за количествено определяне на серумната глюкоза. Накратко, този анализ, базиран на глюкоза оксидаза, води до вторичен продукт на H2O2 от ензимното окисление на пробата глюкоза и последващата реакция на повторно окисление на ензима. След това пероксидазата от хрян катализира окисляването на H2O2 на 3,5-дихлоро-2-хидроксибензенсулфонова киселина и 4-аминоантипирин, за да образува продукти с оптимална абсорбция при 514 nm. След инкубация (37 ° С, 10 минути), абсорбцията (514nm) беше измерена с микропланшетен спектрофотометър (SpectraMax Plus 384, Molecular Devices, Сънивейл, Калифорния).

Подготовка на ABPP проба.

Черният дроб и белите дробове се смилат с бръснач, хомогенизират се в 250 mM буфер захароза върху лед и микрозоми се изолират чрез серийно центрофугиране, както е описано по-рано 18. За определяне на концентрациите на микрозомален протеин е използван комплект Pierce Bicinchronic acid (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); аналитичната абсорбция (562 nm) беше измерена със SpectraMax Plus 384. Микрозомите бяха коригирани с 250 mM захароза до концентрация на протеин от 1,00 mg/ml и бяха приготвени дублирани проби за всяко животно и тъкан с обем 1,00 ml и 0,60 ml за черния дроб и белите дробове съответно. Една проба от всяка двойка беше приготвена като контролни аналози за нулева активност (NA) на проби, подготвени за профилиране на активност P450.

Протеомичен анализ на данни.

Пептидните MS/MS спектри бяха търсени, използвайки функцията за генериране на масови спектри плюс (MSGF +) алгоритъм 25 спрямо публично достъпната последователност на геном на Mus Musculus, преведена (www.uniprot.org; колекция от септември 2013 г.). Изискваха се минимум 6 аминокиселинни остатъка за пептиден анализ и MSGF резултати ≤ 1E-10, което съответства на прогнозната честота на фалшиви открития (FDR) 26. След това съответстващите пептидни характеристики от всеки набор от данни бяха филтрирани върху FDR от ≤ 5%, използвайки статистическите инструменти за показател за доверителност на AMT 27 .

Машина за пушене на цигари, модифицирана да генерира едновременно потоци дим, които имитират активно и пасивно пушене в определени портове на камерата, се използва за излагане на мишки на активен или пасивен цигарен дим или филтриран въздух (NoCSE). Целевите дози за ACSE (250 WTPM/L; 250 ppm CO) и PCSE (85 WTPM/L; 250 ppm CO) се основават на нива, определени от предишни проучвания 14. Реалните доставени дози се поддържат в рамките на 10% от всяка цел, например 254,9 ± 10,6 WTPM/L за ACS и 82,0 ± 6,7 WTPM/L за PCS, със съответните нива на CO съответно 251,2 ± 6,6 ppm и 276,1 ± 8,8 ppm. Всички CSE мишки показват значително повишени нива на карбоксихемоглобин в кръвта (COHb) спрямо контролните мишки NoCSE, докато нивата на COHb са почти еднакви за ACSE и PCSE мишки и не са статистически различни при HFD мишки (Таблица 1).

маса 1.

Нива на карбоксихемоглобин в кръвта (COHb) след 8 дни излагане на цигарен дим.