Катедра по метаболитна регулация

ограничение

Медицинско училище в университета Шиншу

Асахи 3-1-1, Мацумото 390-8621 (Япония)

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Епидемиологичните проучвания разкриват, че излишното затлъстяване, намалените физически упражнения и нездравословната диета повишават риска от рак в различни органи, особено в черния дроб [1, 2]. Хепатоцелуларният карцином (HCC) е едно от често срещаните злокачествени заболявания и водещи причини за смъртност, свързана с рак в световен мащаб [3]. Постоянната инфекция с вирус на хепатит В или вирус на хепатит С (HCV), консумация на етанол и генетични метаболитни нарушения, като хемохроматоза, болест на Уилсън, заболяване за съхранение на гликоген и дефицит на цитрин, са конвенционални рискови фактори за HCC [4, 5]. Напоследък нарастването на затлъстяването и метаболитния синдром в световен мащаб повиши разпространението на HCC, получено от безалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD) и неалкохолен стеатохепатит (NASH) [1-8], което показва тясна връзка между прекомерното хранене и чернодробната туморогенеза.

Въпреки че чернодробната стеатоза може да насърчи развитието на HCC при персистиращо възпаление в резултат на прием на етанол и инфекция с вируса на хепатит, NAFLD/NASH може еднократно да причини HCC не само от циротичен черен дроб, но и от черен дроб без фиброза [6, 7]. Натрупването на мастни киселини (FA) и техните междинни метаболити в хепатоцитите може да засили оксидативния и ендоплазмен ретикулум (ER) стрес и липидната пероксидация, което води до митохондриална дисфункция, увреждане на хепатоцитите и ДНК мутации. С напредването на дегенерацията на хепатоцитите, клетките на Kupffer и чернодробните звездни клетки се активират и чернодробното възпаление и фиброза постепенно прогресират. Промените в целостта на хепатоцитите и микросредата около хепатоцитите инициират и насърчават злокачествена трансформация на хепатоцитите, което в крайна сметка води до HCC [1, 2, 8, 9]. Следователно коригирането на ежедневния начин на живот и смекчаване на хепатостеатозата и затлъстяването се считат за полезни за предотвратяване на чернодробната туморогенеза, свързана с метаболитен синдром и NAFLD/NASH.

Диетичното ограничение (DR) е една от обещаващите стратегии за намаляване на чернодробната стеатоза и системното затлъстяване. Предишни проучвания демонстрират, че хроничното намаляване на приема на диетична енергия с приблизително 30% значително намалява затлъстяването и подобрява метаболитните профили при хора със затлъстяване и гризачи без съпътстващо недохранване [10]. Отбелязана е положителна корелация между приема на храна и кумулативната честота на тумори при мишки [11]. Въз основа на тези открития е разработена хипотеза, че 30% DR може да смекчи появата на HCC, получена от стеатоза. Въпреки това дали DR може действително да предотврати свързаната със стеатоза чернодробна туморогенеза и нейният точен механизъм остава неясно.

За да се справи с тези проблеми, настоящото проучване използва генетична трансгенна гена на HCV (HCVcpTg) мишка, която спонтанно развива инсулинова резистентност на възраст 2-3 месеца, чернодробна стеатоза на възраст 8–9 месеца и хепатоцелуларни тумори при приблизително 30% от мъжки мишки между 16 и 18 месечна възраст, без видимо чернодробно възпаление и фиброза, наподобяващи фенотипа на свързана с NAFLD чернодробна туморогенеза [12, 13]. Следователно въздействието на персистиращия DR върху свързаната със стеатоза чернодробна туморогенеза е изследвано чрез провеждане на 30% намаляване на количеството храна на мишки HCVcpTg за 15 месеца.

Материали и методи

Мишки и лечение

Биохимичен анализ

Серумна аланин аминотрансфераза (ALT), аспартат аминотрансфераза (AST), триглицерид (TG), общ холестерол (TC), неестерифициран FA (NEFA) и глюкоза се измерват с комплекти за анализ на ензими (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Япония). Серумни концентрации на инсулин, инсулиноподобен растежен фактор 1 (IGF1) и адипонектин се определят с помощта на миши инсулинов ELISA комплект (TMB; AKRIN-011T, Shibayagi, Gunma, Япония), миши/плъх IGF-1/IGF1 Quantikine ELISA комплект (MG100, R&D Systems, Минеаполис, MN, САЩ) и ELISA комплект за адипонектин на мишка/плъх (Otsuka Pharmaceutical, Токио, Япония), съответно. Общите чернодробни липиди бяха извлечени съгласно метода хексан: изопропанол [18] и измерени с помощта на идентичните набори (Wako Pure Chemical Industries Ltd). Концентрациите на чернодробния хидроксипролин бяха измерени с помощта на комплекта за анализ на QuickZyme Hydroxyproline (QuickZyme BioSciences, Leiden, Холандия), както е описано другаде [16, 17].

Хистологичен анализ

Малки парченца чернодробна тъкан от всяка мишка бяха фиксирани в 10% буфериран формалин и вградени в парафин. Секции (с дебелина 3 μm) се оцветяват с хематоксилин и еозин или по метода на Azan-Mallory [19, 20].

Експресията на 4-хидрокси-ноненал (4-HNE), фосфорилирана форма на сигнален преобразувател и активатор на транскрипция 3 (p-STAT3) и извънклетъчна сигнално-регулирана киназа (p-ERK) се анализира чрез имунохистохимия. Извличането на антиген се извършва чрез микровълнови тъканни срезове в 10 mM Tris-HCl буфер (рН 8.0), съдържащ 1 mM EDTA за 30 минути за имунооцветяване. Секциите бяха инкубирани 1 час с анти-4-HNE антитяло (No. MHN-020P, JaICA, Shizuoka, Япония, разреждане 1: 5), анти-p-STAT3 антитяло (№ 9145, Cell Signaling Technology, Danvers, МА, САЩ, 1: 100 разреждане) и анти-p-ERK антитяло (No. 4370, Cell Signaling Technology, 1: 500 разреждане), съответно. За вторични антитела бяха използвани Histofine мишен петно ​​за 4-HNE и Histofine Simple Stain MAX-PO® за други, и двете закупени от Nichirei (Токио, Япония). За имунодетекция пероксидазната активност се визуализира, като се използва разтвор на диаминобензидин-водороден пероксид. Специфично оцветяване не е установено при контролни експерименти, при които се пропуска първичното антитяло. Патологичната диагноза е извършена от J.N., сертифициран патолог от Японското общество по патология, и N.T. по независим и заслепен начин.

Количествен анализ на верижната реакция на полимераза

Общата чернодробна РНК беше извлечена с помощта на NucleoSpin RNA Plus Kit (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Германия) и cDNA беше обратно транскрибирана с ReverTra Ace® количествена полимеразна верижна реакция (qPCR) RT Master Mix (Тойобо, Осака, Япония ). Количествата на иРНК са количествено определени с помощта на SYBR qPCR комплект (Toyobo) и Applied Biosystems StepOne Plus PCR система в реално време (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) [16-22]. Към всяка ямка се добавя по един микролитър cDNA аликвотни части. Нивата на тРНК се нормализират до тези на 18S рибозомна РНК и се изразяват като кратни промени спрямо HCVcpTg мишки, хранени с контролна диета ad libitum. Двойките праймери, използвани за анализ на qPCR, са изброени в допълнителна онлайн таблица 1 (за всички онлайн добавящи материали вижте www.karger.com/doi/10.1159/000508308).

Анализ на микрочипове

Имуноблот анализ

Статистически анализ

Стойностите са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Количественият и качествен анализ на данните е извършен с двустранен студент т тест и χ 2 тест, съответно, като се използва SPSS статистика версия 22 (IBM, Armonk, NY, USA). A стр стойност