Резюме

Заден план

Сушените плодове, като стафидите, съдържат фитохимикали и диетични фибри, които допринасят за поддържането на здравето, потенциално поне частично чрез модификация на състава и дейностите на чревната микробиота. Въпреки това, ефектите от консумацията на стафиди върху чревната микробиота не са проучвани преди това при хора. Следователно целта на това проучване е да се определи как добавянето на три порции изсушена на слънце стафида/ден към диетата на здрави доброволци влияе върху състава на микробиотата на червата.

Методи

Проведено е 14-дневно проучвателно проучване за хранене с тринадесет здрави индивида на възраст между 18 и 59 години. Участниците консумираха три порции (по 28,3 г всяка) сушени стафиди дневно. Фекални проби бяха събрани преди консумация на стафиди (изходно ниво) и след добавяне на стафиди към диетата (на 7 и 14 ден). За да се определят ефектите от приема на стафиди, съставът на фекалната микробиота преди и след консумацията на стафиди се характеризира за всеки участник чрез секвениране на 16S рРНК гени.

Резултати

Цялостното разнообразие на микробиота не е повлияно значително чрез добавяне на стафиди към диетата. Въпреки това, при добавяне на стафиди към диетата, специфичните OTUs съвпадат Faecalibacterium prausnitzii, Bacteroidetes sp. и Ruminococcus sp. увеличено разпространение, докато OTUs най-близо до Klebsiella sp., Prevotella sp. и Bifidobacterium spp. намалява.

Заключение

Нашите открития показват, че добавянето на стафиди към диетата може да повлияе на разпространението на специфични бактериални таксони. Потенциалните ползи за здравето от наблюдаваните промени в микробиотата трябва да бъдат определени в бъдещи проучвания при популации, за които могат да бъдат насочени конкретни здравни резултати.

Пробна регистрация

Заден план

Човешките черва съдържат разнообразна колекция от микроби, често наричани чревна микробиота, които взаимодействат с гостоприемника в предимно симбиотичен начин. Взаимодействието между чревната микробиота, диетата и здравето получи повишен изследователски интерес през последните две десетилетия [1, 2] и разкри множество взаимодействия, които могат да допринесат за поддържане на добро здраве [3,4,5]. Чревната микробиота медиирана диетична ферментация на влакна генерира късоверижни мастни киселини (SCFA), които са свързани с ползите за здравето [1, 3, 6,7,8,9]. Приемът на стафиди е свързан с i) намален риск от коронарна болест на сърцето, ii) намален риск от метаболитен синдром, iii) подобрена функция на червата и iv) намалени нива на жлъчните киселини [10,11,12]. В сравнение с прясното грозде стафидите са обогатени с фитохимикали като фенолни киселини и винена киселина, както и с ферментируеми влакна като фруктани от инулинов тип, които влияят върху състава на микробиотата на червата [13,14,15]. Въз основа на приблизително годишно потребление от 205 000 метрични тона [16], средният прием на стафиди на човек в момента в САЩ е само 635 g/година или по-малко от 2 g/ден.

Добавянето на грозде или продукти, получени от грозде (екстракти от стафиди или гроздови джибри) към диетата, показва потенциално полезни промени в чревната микробиота на мишки, пилета, агнета и свине за отбиване [17,18,19,20]. Две проучвания показват противовъзпалителен ефект на стафидите в клетъчна линия на човешки рак на дебелото черво [21] и човешка стомашно-чревна епителна клетъчна линия [22]. Само няколко проучвания обаче са изследвали ефектите на стафидите върху чревната микробиота. Инкубацията на изсушени на слънце стафиди с човешки фекални проби в стомашно-чревен модел промени състава на микробиотата в рамките на 24 часа [15]. По този начин е необходимо да се определят ефектите на стафидите върху чревната микробиота и да се установят потенциални ползи за здравето при хората.

В това проучване ние изследвахме как добавянето на стафиди към нормалната диета на здрави доброволци променя състава на чревната им микробиота. Въз основа на предишната литература предположихме, че приемът на стафиди може значително да промени състава на чревната микробиота при възрастни в сравнение с базовия състав.

Методи

Уча дизайн

Критерии за набиране на участници

Набрахме потенциални участници в проучването в Университета на Флорида между януари 2016 г. и март 2016 г. и записахме лица на възраст между 18 и 75 години с общо здраве и с дефекация поне три пъти седмично. Изключихме потенциални участници, които i) са имали основни храносмилателни разстройства като стомашни язви, синдром на раздразненото черво, непоносимост към лактоза, хроничен запек или диария, ii) са имали промени в телесното тегло над 10% през последните три месеца и iii) са взели лекарства, които засягат функцията на червата или микробиотата, като лаксативи и антибиотици, през последния месец.

Първоначално бяха записани осемнадесет участници. Участниците предоставиха информация за демографските си данни, общото здравословно състояние и модела на физическа активност. Във всяко вземане на проби участниците предоставят здравна информация за стомашно-чревния тракт, използвайки въпросник. Тринадесет участници завършиха протокола от изследването и бяха включени в окончателния анализ (Допълнителен файл 1: Фигура S1).

Диетична намеса

Участниците бяха помолени да не консумират никакви добавки или храни, които биха могли да повлияят на функцията на червата или микробиотата (пробиотици/пребиотици, продукти за почистване на храносмилането, стимулиращи лаксативи, стимуланти на жлъчните киселини) и да ограничат приема на алкохол до една напитка на ден.

Всеки участник беше помолен да консумира три порции предварително опаковани стафиди, изсушени на слънце (Sun-Maid Growers California) на ден за период от 14 непрекъснати дни. Една порция съдържа 28,3 г стафиди и осигурява 90 кал и 2 г диетични фибри. Съответствието с протокола от изследването беше оценено на 7 и 14 ден чрез разпит на участниците за тяхното спазване.

Събиране на фекални проби

Участниците предоставиха първата фекална проба в деня преди началото на консумацията на стафиди (изходно ниво) и след една седмица (ден 7) и две седмици (ден 14) на консумация на стафиди. Фекалните проби бяха транспортирани до лабораторията в рамките на 6 часа след дефекацията и незабавно обработени и съхранявани при - 20 ° C до екстракция на ДНК.

ДНК екстракция и PCR амплификация

ДНК от 39 фекални проби (три проби от всеки индивид) беше изолирана, използвайки модифициран протокол за екстракция на фекална ДНК на Qiagen с начален етап на биене на зърна, както беше описано по-горе [23]. ДНК пробите се амплифицират с помощта на баркодирани праймери Illumina, насочени към V1 и V2 региона на бактериалния 16S rRNA ген (използван е универсален набор от праймери 27F и 533R).

ДНК секвениране и групиране в оперативни таксономични единици (OTU)

Пробите се обединяват чрез комбиниране на еквимоларни количества от 39 различни PCR продукта за мултиплексирано секвениране. Ампликоните бяха секвенирани с помощта на платформата Illumina MiSeq. От получените сурови данни от анализа бяха отстранени последователности с ниско качество (филтър за качество USEARCH и откриване на химера) или със сдвоена дължина на четене по-малка от 290 нуклеотида. Използвайки модифициран UPARSE алгоритъм, последователностите бяха групирани в оперативни таксономични единици (OTU) при нива на сходство от 95 и 98%. Представителна последователност от всяка OTU беше анотирана чрез референтната база данни на гена „Greengenes“ 16S rRNA, използвайки байесов RDP класификатор [24].

Анализ на данни

Сравнихме състава на микробиотата на червата (мерки за разнообразие на ядрото, относително изобилие от бактериална фила и разпространение на отделни OTU) на фекални проби, предоставени от всеки участник през седмица 1 и седмица 2 (след прием на стафиди) с състава на микробиотата на червата в началото, за да идентифицираме промени след прием на стафиди.

Основните мерки за разнообразие, кривата на разреждане Chao1 за алфа разнообразие и графики за анализ на основните компоненти на претеглени разстояния UniFrac за бета разнообразие са генерирани с помощта на софтуерния пакет QIIME и пакета R phyloseq [25, 26]. Също така изчислихме индекса на Шанън-Уивър и Симпсън (индекси на алфа разнообразие) и средните разстояния на UniFrac.

Изчислихме процентното относително изобилие на бактериална фила, чрез комбиниране на OTU със същата таксономична класификация на ниво фил в съответната група филуми. OTU, отбелязани като „некласифицирани“ или класифицирани само до нивото на царството, бяха подравнени ръчно с помощта на BLAST [27]. Последователностите, съответстващи на фаги или вектори, и/или последователности с резултат на сходство и обхват на заявката по-малко от 95% бяха изключени от анализа.

Значимостта на разликите в дела на участниците, показващи наличието/отсъствието на специфични OTU, е изчислена с помощта на z-теста (стр-стойност

Резултати

Характеристики на участника

Тринадесетте участници бяха на възраст между 18 и 59 години; 62% от участниците са жени, 53% с наднормено тегло или затлъстяване (ИТМ ≥ 25,0 kgm - 2), 54% посочват умерени до енергични нива на физическа активност. Участниците не съобщават за дискомфорт (стомашно-чревно здраве) по време на периода на хранене със стафиди. Множество участници обаче съобщават за затруднения с консумацията на относително голямото количество от три порции от 28,3 g стафиди дневно за непрекъснат период от 14 дни.

Изход за секвениране

16S rRNA генно секвениране с помощта на платформата Illumina MiSeq генерира общо 5 533 527 четения на последователности. След отстраняване на нискокачествени и краткотрайни последователности, бяха запазени общо 4 477 275 последователности със средна сдвоена дължина на последователността 322,25 нуклеотида. Binning при 95 и 98% нива на сходство доведе до 1238 и 2168 уникални OTU, съответно. След отстраняване на единични животни запазихме средно 106 475 последователности/проба на ниво 95% сходство и 103 653 последователности/проба на ниво 98% сходство.

Анализ на основното разнообразие

Кривата на разреждане Chao1 предполага, че сме достигнали достатъчна дълбочина на секвениране и че богатството на OTU не се различава значително между нито един от трите периода от време (Допълнителен файл 2: Фигура S2). Консумацията на стафиди не е повлияла на други мерки за алфа разнообразие (данните не са показани). Анализът на разнообразието на UniFrac, мярка за бета разнообразие (между разнообразието на пробите) показва, че варирането между отделните индивиди е голямо и въздействието на стафидите върху цялостната структура на микробиотата е ограничено (Допълнителен файл 3: Фигура S3). Средните разстояния на UniFrac между участниците не се различават съществено през всеки период от време, подкрепящи аргумента, че приемът на стафиди няма ефект върху цялостния състав на микробиотата (данните не са показани).

Относително изобилие от бактериална фила

След това определихме ефектите на стафидите на ниво филум; изобилието не е повлияно значително от консумацията на стафиди (фиг. 1). Въпреки че имаше индикации за тенденция към повишено относително изобилие на Bacteroidetes и намалено относително изобилие на Firmicutes, тези наблюдения на ниво тип не достигнаха статистическа значимост.

прием

Относително изобилие на бактериална фила по проба (%, н = 13). OTU, които имат средно изобилие от последователност по-малко от 1.0%, бяха групирани в „Други“, които включваха цианобактерии, фузобактерии, Lentisphaerae, Synergistetes, Tenericutes, TM7 и Verrucomicrobia. Всяка колона показва разпределението на типа (%) на чревната микробиота на фекална проба. ID на пробата обозначава идентификатора на участника и периода от време (изходно ниво - 1; една седмица след прием на стафиди - 2; две седмици след прием на стафиди - 3)

OTUs значително засегнати от консумацията на стафиди

И накрая, идентифицирахме както на 95%, така и на 98% ниво на сходство специфични OTU, които бяха значително засегнати от приема на стафиди (фиг. 2 и фиг. 3). И на двете нива на сходство броят на OTU, които се различават от изходното ниво, беше по-голям през седмица 1 от седмица 2 (16 срещу 11 OTU при 95% сходство и 27 срещу 16 OTU при 98% ниво на сходство). Faecalibacterium prausnitzii значително се увеличи след седмица 1 на прием на стафиди и това увеличение продължи и през седмица 2 на консумация на стафиди (фиг. 3). Множество OTU, съответстващи на Ruminococcaceae, както и Bacteroidetes spp значително се увеличи през двата периода на интервенция. Въпреки че едно OTU съвпадение Bifidobacterium spp. значително намалява с консумацията на стафиди, друга OTU, класифицирана като Bifidobacterium longum се увеличи през седмица 2 в сравнение със седмица 1. Наблюдавахме и значително намаляване на съвпадението на OTU Klebsiella sp. след седмица 1, докато OTU съвпада Prevotella sp. намалява след седмица 1 и седмица 2 на консумация на стафиди.

Дискусия

В сравнение с изходното ниво, броят на OTU, които се променят значително, е по-голям през първата седмица, отколкото седмица 2. Това може да означава, че въвеждането на стафиди има предимно краткосрочни ефекти върху микробиотата. Като алтернатива, това наблюдение е в съответствие с докладите на участниците, които показват намалено съответствие през седмица 2 поради нежелание да се консумира необходимото количество стафиди.

Нашето проучване беше ограничено от малкия брой участници, които показаха широк диапазон от възраст, ИТМ, хранителни навици и основния състав на микробиотата [43,44,45]. Тези големи индивидуални вариации намаляват способността ни да наблюдаваме свързаните с приема на стафиди ефекти и вероятно намаляват истинската степен на ефекта на стафидите върху чревната микробиота. Освен това, тъй като това беше пилотно проучване с малък размер на извадката, ние не се приспособихме за множество тестове в нашия изследователски анализ. Въпреки че наблюдавахме няколко промени в OTU при участниците в изследването, които консумираха стафиди по време на периода на изследването, без потвърждаващо проучване с по-голям размер на извадката тези резултати трябва да се тълкуват с повишено внимание.

Заключения

В това пилотно проучване наблюдавахме множество бактериални таксони, които се променяха в разпространението с добавяне на стафиди към диетата на здрави доброволци. По-широките показатели за разнообразието на микробиотите не са засегнати от приема на стафиди. Докато специфичните OTU, представляващи бактериални таксони, които са се променили при прием на стафиди в нашето малко проучване, може да не се наблюдават при други популации, някои промени в нивото на OTU вероятно ще настъпят в други популации. Бъдещите проучвания трябва да включват добре дефинирани здравни резултати, за да се установи дали микробните промени в резултат на приема на стафиди корелират с ползите за здравето.

Съкращения

Основен инструмент за локално подравняване

Оперативни таксономични единици

Количествени прозрения в микробната екология