Енрике Васкес

1 Стратегически отдел за научноизследователска и развойна дейност, Abbott Nutrition, Гранада, 18004, Испания

Алехандро Баранко

1 Отдел за стратегически изследвания и разработки, Abbott Nutrition, Гранада, 18004, Испания

Мария Рамирес

1 Стратегически отдел за научноизследователска и развойна дейност, Abbott Nutrition, Гранада, 18004, Испания

Агнес Груарт

3 Отдел по неврология, Университет Пабло де Олавиде, Севиля, 41013, Испания

Хосе М. Делгадо-Гарсия

3 Отдел по неврология, Университет Пабло де Олавиде, Севиля, 41013, Испания

Мария Л. Хименес

1 Стратегически отдел за научноизследователска и развойна дейност, Abbott Nutrition, Гранада, 18004, Испания

Рейчъл Бък

2 Отдел за стратегически изследвания и разработки, Abbott Nutrition, Columbus, OH, Съединени американски щати

Рикардо Руеда

1 Стратегически отдел за научноизследователска и развойна дейност, Abbott Nutrition, Гранада, 18004, Испания

Концептуализация: EV AB MR RB RR.

Куриране на данни: JMD AG EV AB.

Официален анализ: EV AB MR AG JMD.

Придобиване на финансиране: EV MR RB RR.

Разследване: EV AB MR MLJ JMD AG RB RR.

Методология: EV AB MLJ AG JMD.

Администрация на проекта: EV RB.

Ресурси: EV AB MR MLJ JMD AG RB RR.

Надзор: EV RB MR RR.

Проверка: EV MLJ JMD AG AB.

Визуализация: EV.

Писане - оригинален проект: EV AB MR MLJ JMD AG RB RR.

Писане - преглед и редактиране: EV MR JMD RB RR.

Свързани данни

Всички съответни данни са в хартията.

Резюме

2´-фукозилактоза (2´-FL) е богат олигозахарид в човешкото мляко (HMO) в човешкото мляко с разнообразни биологични ефекти. Наскоро съобщихме, че погълнатият 2´-FL стимулира функцията на централната нервна система (ЦНС), като дългосрочно потенциране на хипокампа (LTP) и обучение и памет при плъхове. Възможно е ефектът на 2´-FL върху функцията на ЦНС да бъде чрез оста на червата и мозъка (GBA), по-специално блуждаещия нерв, а L-фукозата (Fuc) може да играе роля. Това проучване имаше две цели: (1) да определи дали ефектът на погълнатия 2´-FL върху модулацията на функцията на ЦНС зависи от целостта на молекулата; и (2) потвърждават дали орален 2´-FL модифициран хипокампален LTP и свързани с асоциативното обучение умения при плъхове, подложени на двустранна субдиафрагмална ваготомия. Резултатите показаха, че 2´-FL, но не и Fuc засилва LTP, а ваготомията инхибира ефектите на оралния 2´-FL върху LTP и парадигмите, свързани с асоциативно обучение. Взети заедно, данните показват, че диетичният 2´-FL, но не и неговият Fuc остатък засяга когнитивните области и подобрява обучението и паметта при плъхове. Този ефект зависи от целостта на блуждаещия нерв, което предполага, че GBA играе роля в когнитивните ползи, медиирани от 2´-FL.

Въведение

Богатството на HMO в човешкото мляко е уникално не само по отношение на общото количество, но и предвид тяхното разнообразие и сложност. Към днешна дата са идентифицирани повече от 150 HMO [1,2], като 2’-фукозилактоза (2’-FL) е най-разпространената HMO, до 4,65 g/L [3]. От друга страна, олигозахаридите в говеждото мляко и следователно в адаптираните храни за кърмачета са много по-малко в изобилие и сложни [4, 5]. Кърменето носи разнообразни ползи [6, 7]. Например, кърмените деца имат по-висок коефициент на интелигентност и по-добри резултати в тестовете за интелигентност по-късно в живота в сравнение с тези, които са били хранени с адаптирано мляко [6, 8].

Няма налична информация за механизмите, залегнали в ефекта на диетичния 2´-FL върху мозъчната функция. Нарастващият набор от доказателства подчертава значението на оста на червата и мозъка за подходящото развитие на много функции на ЦНС [19–21], по-специално на блуждаещия нерв като ключов път в тази кръстосана препратка между червата и мозъка. Съответно е показано, че стимулацията на блуждаещия нерв засилва хипокампалния LTP при свободно движещи се плъхове [22]. Освен това, Bienenstock et al. показа фукозилирани, но не сиалилирани HMO модулират моторните контракции на дебелото черво, вероятно чрез тригериране на ентерични неврони [23]. Пионерските проучвания демонстрират, че [3 H] Fuc, прилаган интракраниално, бързо се включва в невроналните гликопротеини и се прехвърля в нервните окончания, което предполага активен процес на аксонен транспорт на фукозилови конюгати [24].

Вземайки предвид тези доказателства, ние предположихме, че диетичният 2’-FL упражнява модулаторния си ефект върху ЦНС, като задейства ентеричните неврони и тези стимули могат да достигнат до ЦНС през пътя на блуждаещия нерв. В тази работа ние измерихме in vivo хипокампален LTP при плъхове, хранени с 2´-FL или фукоза, както и ефекта от диетичния 2´-FL върху когнитивните умения и хипокампалния LTP при плъхове, подложени на двустранна субдиафрагмална ваготомия.

Материали и методи

Експериментални животни

Sprague Dawley мъжки възрастни плъхове (на възраст 2,5–4 месеца; 250–300 g) са предоставени от Charles River Laboratories. Плъховете се настаняват по двойки и се държат на 12-часов цикъл светлина/тъмнина с контролирана околна температура и влажност съответно 21,5 ± 1 ° C и 55 ± 8%. Храната и водата се предлагаха ad libitum. Животните, посветени на ваготомия, както и на LTP проучвания, се държат индивидуално след хирургични процедури. За експерименти, илюстрирани на фигура 1В, животните (n = 10 на група) са разделени на три групи: Control, Fucose и 2’-FL. Експериментите, илюстрирани на фиг. 1С (n = 10 на група), бяха разделени на четири групи: Control-Sham, Control-Vagotomized, 2’-FL-Sham и 2’-FL-Vagotomized. И накрая, експериментите, илюстрирани на фигура 2, бяха проведени с допълнителни животни (n = 10 на група), разделени в гореспоменатите четири групи.

подобрява

Електрофизиологични изследвания

Електрофизиологичните изследвания започват 1 седмица след операцията. Както беше описано по-рано от Gureviviene и колеги [28], електрофизиологичните записи бяха извършени с помощта на диференциални усилватели Grass P511 с честотна лента от 0,1 Hz-10 kHz (Grass-Telefactor, West Warwick, RI, USA). Потенциалите на синаптичното поле в зоната CA1 бяха предизвикани от единичен 100 μs, квадратен, двуфазен (отрицателно-положителен) импулс, приложен към обезпеченията на Schaffer. Интензитетът на стимула варира от 50 до 350 μA. За всяко животно интензивността на стимула беше зададена доста под прага за предизвикване на скок на популацията, обикновено 30-40% от интензивността, необходима за предизвикване на максимален fEPSP отговор [28]. Допълнителен критерий за избор на интензивност на стимула беше, че втори стимул, представен 50 ms след кондициониращ импулс, предизвиква по-голям (> 20%) потенциал на синаптичното поле [29].

За предизвикване на LTP се използва високочестотен (HFS) протокол: на всяко животно бяха представени пет 200 Hz, 100 ms влакови импулси със скорост 1/s. Тези влакове бяха представени общо 6 пъти, на интервали от 1 мин. 100 μs, квадратни, двуфазни импулси, използвани за предизвикване на LTP, бяха приложени със същия интензитет, използван за извикване на изходни записи (вж. [15] за допълнителни подробности за този хроничен препарат). Записите на изходното ниво бяха събрани в продължение на 15 минути с представяне на сдвоени стимули на всеки 20 s. След протокола HFS, fEPSP се записват отново за 30 минути. В случая на експеримента, илюстриран на фиг. 1В, бяха извършени допълнителни записи в продължение на 15 минути през следващите 2 дни. В случая на експеримента, илюстриран на фиг. 1С, един ден след първия протокол HFS, извършихме второ изходно (15 минути) записване и втори HFS беше представен на експерименталните животни. След този втори HFS, fEPSP бяха записани отново за 30 минути. Допълнителни записи бяха извършени в продължение на 15 минути през следващите 3 дни [17].

Хистология за тестване на местоположението на електрода

Както беше споменато по-горе [17], след приключване на експериментите, плъховете бяха дълбоко повторно анестезирани (натриев пентобарбитал, 50 mg/kg) и перфузирани транскардално с физиологичен разтвор и 4% фосфатно буфериран параформалдехид. Избрани участъци от 50 μm, включително гръбния хипокампус, бяха поставени върху стъкла от желатинизирано стъкло и оцветени с оцветяване на Nissl с 0,1% толуидиново синьо, за да се потвърди правилното местоположение на стимулиращите и записващи електроди.

Оперантно кондициониране на плъхове

Статистически анализ

Резултати

Хроничното перорално приложение на 2’-FL, но не и фукоза подобрява LTP

Ваготомията инхибира ефекта на 2’-FL върху LTP

Ваготомията предотвратява потенциращите ефекти на 2’-FL върху оперантно кондициониране

Дискусия

Периферните компоненти на GBA се свързват с централната нервна система чрез няколко канала като ентерична, автономна и симпатикова нервна система [33, 40]. Все повече доказателства посочват, че чревните микроби могат да модулират развитието и функционирането на мозъка [41, 42] чрез ентеричната нервна система (ENS). ENS се намира в чревната стена и аномалиите в ENS са свързани с широк спектър от стомашно-чревни разстройства както при възрастни [43], така и при бебета [33]. ENS се свързва с мозъка чрез блуждаещия нерв и дорзалния корен, както и нодозните ганглии [40], а аферентният вагусен нерв е основната ретроградна сигнална система от червата до мозъка [44]. Доказателства за последното бяха предоставени от поглъщането на щам Lactobacillus, показан да регулира емоционалното поведение и експресията на централния GABA рецептор поради целостта на блуждаещия нерв [26]. Освен това стимулацията на блуждаещия нерв потенцира хипокампалния LTP при свободно движещи се плъхове [22].

Последните прегледи подчертават важността на връзката между микробиома и регулацията на ENS [19, 41]. Пребиотичният характер на HMOs и тяхната спекулирана роля за поддържането на адекватна микробна общност в новороденото черво е едно от най-препоръчваните свойства на HMOs [45]. HMO се противопоставят на процесите на храносмилане и служат като предпочитани метаболитни субстрати за избрани микроби, допринасяйки за микробиома на бебето в червата [46]. Вариациите в баланса на обикновените чревни микроорганизми могат да променят производството на късоверижните мастни киселини, които са продукти на чревната бактериална ферментация, които играят ключова роля за функцията на ЦНС [47, 48]. HMOs също са докладвани като фактори, индуциращи чревното съзряване [49], както и като предотвратяване на патологични аберации на чревната лигавица, толкова тежки, колкото некротизиращия ентероколит [50]. По този начин HMO играят регулаторна роля в интерфейса на микроб и чревна лигавица. HMO също могат да активират съставките на ENS, пребиваващи в чревната стена. В този смисъл се съобщава, че фукозилираните HMO (като 2´-FL) намаляват моторните контракции на дебелото черво в модел ex vivo [23], разкривайки директен стимул на ентеричните нерви от фукозилирани HMO, въпреки че авторите също предполагат, че могат стимулират мозъка чрез блуждаещия нерв.

Въз основа на доказателствата предположихме, че аферентният блуждаещ нерв може да участва в модулаторния ефект на погълнатия 2´-FL върху мозъчната функция. В това проучване потвърдихме тази хипотеза, при която двустранната ваготомия предотврати улесняващия ефект на 2´-FL върху LTP (Фигура 1C). По същия начин, фалшиво оперирани животни, хранени с диета, допълнена с 2´-FL, показват потенциран LTP (фиг. 1C), както и по-добри резултати в тестове, свързани с асоциативно учене (фиг. 2C и 2D), в съответствие с докладваните по-рано данни [17]. Нарушаването на вагусния път доведе до изучаването на десетки ваготомизирани плъхове, хранени с 2´-FL животни, до тези от контролни плъхове. Въпреки че нашето изследване на LTP се фокусира върху хипокампуса, погълнатият 2’-FL също повлиява на оперантното кондициониране, което предполага, че могат да участват други невронални вериги извън хипокампуса [51]. Следователно е много възможно 2´-FL да модулира различни мозъчни области чрез задействане на ентерични неврони и възбуждащите сигнали могат да достигнат до мозъка през вагусния път на GBA.

Заключение и заключителни бележки

В обобщение, орално прилаганият 2’FL подобрява мозъчната функция и познанието чрез блуждаещия нерв при плъхове. Погълнатият Fuc не оказва тези ефекти, въпреки че Fuc частта може да подобри LTP и способностите за учене/памет чрез интравентрикуларна или интраперитонеална инжекция. Погълнатият Fuc не е оказал ефект върху регулацията на синапсиса, което предполага, че молекулярната цялост на 2’FL в червата е необходима, за да предизвика благоприятни ефекти върху функцията на ЦНС. Освен това аферентният път на блуждаещия нерв е основният път за предаване на ентерични сигнали, генерирани от наличието на 2´-FL от червата до мозъка.

Въпреки факта, че 2'-FL присъства в урината [57, 58] и плазмата [56] на кърмените бебета и се абсорбира и транспортира през кръвния поток без модификация, няма публикуван доклад, потвърждаващ наличието на 2'-FL в мозъка, нито механизъм за преминаване на кръвно-мозъчната бариера. Впоследствие изяснихме GBA и по-точно връзките на блуждаещия нерв участват в механизма на действие, чрез който диетичният 2’-FL подобрява когнитивните способности при модели на гризачи.

Отчет за финансиране

Изследването е финансирано изключително от Abbott Nutrition. Финансистът предостави подкрепа под формата на заплати за автори [EV, AB, MR, MLJ, RB, RR], както и бюджет за разходи, свързани с експериментална работа. Финансистът няма никаква допълнителна роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Конкретните роли на тези автори са формулирани в раздела „авторски приноси“.