Пио Мария Фурнери

Катедра по микробиологични науки и гинекологични науки, Университет на Катания, Катания, 1 Катедра по фармакохимия, 2 Катедра по фармакобиология, Университет в Месина, Месина, Италия 3

антимикоплазмена

Анна Пиперно

Катедра по микробиологични науки и гинекологични науки, Университет на Катания, Катания, 1 Катедра по фармакохимия, 2 Катедра по фармакобиология, Университет в Месина, Месина, Италия 3

Антонела Саджия

Катедра по микробиологични науки и гинекологични науки, Университет на Катания, Катания, 1 Катедра по фармакохимия, 2 Катедра по фармакобиология, Университет в Месина, Месина, Италия 3

Джузепе Бисиняно

Катедра по микробиологични науки и гинекологични науки, Университет на Катания, Катания, 1 Катедра по фармакохимия, 2 Катедра по фармакобиология, Университет в Месина, Месина, Италия 3

Резюме

Целта на това проучване е да се изследва in vitro антимикоплазмената активност на хидрокситирозола. Използвани са двадесет щама Mycoplasma hominis, три щама Mycoplasma fermentans и един щам Mycoplasma pneumoniae. За M. pneumoniae, M. hominis и M. fermentans, MIC са съответно 0,5, 0,03 (за 90% от тестваните щамове) и 0,25 μg/ml.

Типичните компоненти на средиземноморската диета, като зехтин и червено вино, съдържат високи концентрации на сложни феноли, които са надарени със силна антиоксидантна активност. Също така в средиземноморския басейн зехтинът, заедно с плодовете, зеленчуците и рибата, са важни съставки на диетата и се считат за основни фактори за запазване на здравословно и относително безболезнено население. Епидемиологичните данни показват, че средиземноморската диета има значителни защитни ефекти срещу рак и коронарна болест на сърцето.

Нарастващата резистентност към антибиотици представлява основният фактор, оправдаващ необходимостта от намиране и разработване на нови антимикробни агенти. По този начин много изследвания са фокусирани върху антимикробните свойства на растителните активни съставки (като подправки и етерични масла), които се използват дълго време в традиционната медицина за преодоляване на инфекции (7).

Плодовете и листата на маслината (Olea europaea L.) съдържат поредица от съединения, които представляват мултихимични механизми за защита срещу атаки на микроби и насекоми. Има ясни доказателства относно антимикробната активност на съединенията, съдържащи се в маслини, зехтин и листа и растителни води. По-специално се предлага възможното използване на биосъединения на O. europaea срещу човешки патогенни бактерии (4, 5, 9, 17).

Основните фенолни съединения, идентифицирани и количествено определени в зехтина, принадлежат към три различни класа: прости феноли (хидрокситирозол и тирозол), секоиридоиди (олевропеин, агликонът на лигстрозид и съответните им декарбоксилирани диалдехидни производни) и лигнани [(+) - 1- ацетоксипинорезинол и пинорезинол]. Напоследък е доказано, че олевропеинът (горчивата молекула, присъстваща в големи количества в маслините) и хидрокситирозолът (който произлиза от олевропеин чрез кисела или ензимна хидролиза и е отговорен за високата стабилност на зехтина) (4, 21) инхибират или забавят скорост на растеж на редица бактерии и гъбички, така че те могат да бъдат ефективно използвани като алтернативни хранителни добавки или в интегрирани програми за борба с вредителите (3, 6, 11, 14-16). Освен това демонстрирахме добрата антимикробна активност на олевропеин и хидрокситирозол срещу American Type Culture Collection и клинично изолирани грам-положителни и грам-отрицателни бактериални щамове (Salmonella sp., Vibrio sp. И Staphylococcus aureus) (4). Тъй като е доказано, че олеуропеин също инхибира микоплазмите (8), ние проведехме описаното тук изследване с цел да определим in vitro чувствителността на Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis и Mycoplasma fermentans към хидрокситирозол.

Хидрокситирозолът се синтезира, както е описано по-рано от Bisignano et al. (4). Приготвя се работен разтвор в 0,1 М фосфатен буфер и крайното рН е същото като това на тестовата среда.

Деветнадесет ниско преминаващи клинично изолирани щамове на M. hominis (вагина, уретра и изолати на шийката на матката), един референтен щам (PG 21) на M. hominis, един референтен щам (FH) на M. pneumoniae и един щам с нисък пасаж (вагинален изолат) и два референтни щама (PG18 и K7) на M. fermentans бяха изследвани.

M. hominis се отглежда в 10-В бульон (рН 6,0) (13), съдържащ 1% аргинин вместо урея. M. pneumoniae и M. fermentans са отгледани в SP-4 (18). Всички щамове се поддържат замразени (-80 ° С), докато се анализират срещу лекарството.

MIC се определя чрез тест за микроразреждане с бульон, който по същество е еквивалентен на тест за инхибиране на метаболизма, както е описано по-рано (12). Бульонът от микоплазма (0,025 ml от специфичния бульон) се инокулира в ямките с микротитър. Основният разтвор (0,025 ml) от всяко лекарство се добавя към първата ямка и се правят серийни двукратни разреждания (0,025 ml) с многоканална пипета, започваща с втората ямка; крайните 0,025 ml се изхвърлят и се приготвят общо 11 лекарствени концентрации. Към всяка ямка, съдържаща лекарствата, се добавя суспензия от организми (0,175 ml). Плаките се запечатват с прозрачен ацетат и се инкубират при 37 ° С при атмосферни условия.

Всеки щам се клонира три пъти преди теста и след това се използва за определяне на MIC. Броят на добавените организми се проверява, като се правят серийни 10-кратни разреждания, за да се осигури адекватно (10 3 CFU/ml), но не и прекомерно (> 10 5 CFU/ml) количество инокулум за тестовата система. Всички микроплаки се изследват след 18 часа инкубация и след това веднъж дневно, докато настъпи растеж в контролната епруветка на организма. MIC се определя като най-ниската концентрация на антибиотик, която инхибира промяната на цвета в бульона, причинена от даден щам Mycoplasma по време, когато цветът на контролната епруветка се променя, т.е. когато рН на средата намалява от 7,5 на 7,0 (M. pneumoniae и M. fermentans) или се е увеличил от 6,0 на 6,5 (M. hominis). Изискваните инкубационни времена са били от 24 до 48 часа за M. hominis и M. fermentans и от 3 до 5 дни за M. pneumoniae. По-нататъшни инкубации не бяха проведени. Всеки щам на микоплазма е тестван шест пъти срещу всеки антимикробен агент. Щамовете бяха тествани допълнително шест пъти, в различни дни, с лекарството, за да се осигури възпроизводимостта на резултатите.

Положителна контрола (растеж), състояща се от организми в бульон, отрицателна контрола (стерилност), състояща се от неинокулиран бульон, и лекарствена контрола, състояща се от бульон с най-високи лекарствени концентрации, бяха включени за всеки изследван микоплазмен щам. S. aureus ATCC 29213 е включен като контрола; MIC на лекарството, получено в бульона на Muller-Hinton, беше сравнено с това, получено в микоплазмена среда. Този референтен щам беше инокулиран в микротитърни плаки, съдържащи 10-В бульон, бульон SP-4, бульон Muller-Hinton II (Becton Dickinson & Co., Sparks, Md.), И подходящите разреждания на лекарството, тествано за определяне на MIC. Тези контролни процедури се повтарят всеки път, когато се извършва анализ.

Резултатите от тестовете за чувствителност са дадени в таблица Таблица1. 1. Хидрокситирозолът инхибира микоплазмите при концентрации от 0,03 до 0,5 μg/ml. MIC за M. pneumoniae, M. hominis и M. fermentans са съответно 0,5, 0,03 и 0,25 μg/ml. Що се отнася до възпроизводимостта, в отделните анализи не се наблюдават вариации между резултатите от MIC. Следователно, 10-B и SP-4 дават MIC на хидрокситирозол от 4,0 μg/ml за S. aureus, което е равно на полученото за този щам в бульона на Мюлер-Хинтон.

МАСА 1.

Чувствителността на M. hominis, M. fermentans и M. pneumoniae към хидрокситирозол

Микроорганизъм (брой щамове) MIC (μg/ml) 50% от щамовете 90% от щамовете Обхват
Mycoplasma hominis (20)0,030,030,03-0,12
Mycoplasma fermentans (3) 0,25
Mycoplasma pneumoniae (2) 0,5

Антимикробната активност на естествените съединения е разгледана наскоро в литературата и съществува значителен интерес към използването на тези съединения като нови антимикробни агенти при хората (7). Разбира се, безопасността и бионаличността са основни съображения за антимикробните агенти, които трябва да се използват за терапия при хора. Няколко статии съобщават за добрата бионаличност на хидрокситирозол след поглъщане на зехтин или на чистата активна съставка при хората (10, 19, 20). Въпреки че плазмените концентрации на хидрокситирозол и/или неговите метаболити при хора, консумиращи зехтин, все още не са описани, когато нивата на хидрокситирозол са измерени в плазмени проби от доброволци след еднократно поглъщане на 25 ml необработен зехтин (доза, близка до дневната прием на масло в средиземноморските страни), беше достигната максимална концентрация от 25 μg/литър (10). Освен това се съобщава, че разположението на хидрокситирозол при хора зависи от дозата (19, 20).

Освен това зехтинът доказа своята безопасност в продължение на много години употреба и консумация от хората. Aeschbach et al. (1) и Aruoma et al. (2) наблюдават лека in vitro прооксидантна активност на хидрокситирозол върху ДНК, но само при нефизиологични, милимоларни концентрации. Освен това за маслиновите полифеноли (включително хидрокситирозол) обикновено се твърди, че са без токсичност срещу клетките на бозайници (7).

Настоящите открития показват, че хидрокситирозолът може да се разглежда като обещаващ антимикробен агент за лечение на човешки инфекции; неговата безопасност (7) и добра бионаличност (10, 19, 20) представляват допълнителни предимства за възможната терапевтична употреба.

Следователно може да се предположи, че приемът на диети на полифенолите, съдържащи се в маслините и зехтина, може да намали риска от микоплазмена инфекция. Ние вярваме, че микоплазмите могат да бъдат интересен инструмент за изследване и по-добро характеризиране на взаимодействието на хидрокситирозола с бактериологичната мембрана. Необходими са допълнителни проучвания за изясняване на тези две точки.