1 Zhejiang University of Technology, Hangzhou, Zhejiang 310014, China

алкохолът

2 Китайски медицински университет Zhejiang, Ханджоу, Zhejiang 310053, Китай

3 Медицински университет Уенжоу, Уенжоу, Zhejiang 325035, Китай

Резюме

Цели. Мастната чернодробна болест (FLD) е основна причина за заболеваемост и смъртност в световен мащаб. Диетичният холестерол и консумацията на алкохол са важни рискови фактори за прогресията на FLD, но дали и как алкохолът предизвиква по-тежък FLD с поглъщане на холестерол, остава неясно. Тук основно използвахме диетата на Либер-ДеКарли, за да установим модела на мишката FLD за изследване на синергичните ефекти на метаболизма на алкохола и холестерола върху увреждането на черния дроб. Индексите на аспартат трансаминаза (AST), аланин трансаминаза (ALT), липопротеинов холестерол с ниска плътност (LDL-c) и нива на общ холестерол (TC), огнища на възпаление и патогенеза от хематоксилин и еозин (H&E) и Oil Red O оцветяването разкрива, че алкохолът предизвиква по-тежко увреждане на черния дроб, като влияе върху метаболизма на холестерола, което може да е свързано главно с влиянието на абсорбцията, синтеза и екскрецията на холестерола върху черния дроб или тънките черва. Освен това, инхибирането на абсорбцията на чревния холестерол, но не на мазнините, захарозата и алкохола, абсорбирането в метаболизма на организма от Езетимиб, значително подобрява FLD при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини и холестерол-захароза и алкохол. Тези резултати показват, че алкохолът играе важна роля в метаболизма на холестерола при FLD.

1. Въведение

Мастната чернодробна болест (FLD), включително главно алкохолна мастна чернодробна болест (AFLD) и неалкохолна мастна чернодробна болест (NFALD), е основна причина за заболеваемост и смъртност в световен мащаб. Заболеваемостта от NAFLD е 15% в Китай и 12,9

46% в световен мащаб, докато AFLD е 4,5% в Китай [1]. Спектърът на FLD обхваща стеатоза, стеатохепатит, прогресивна фиброза и хепатоцелуларен карцином и е повлиян от множество фактори, включително злоупотреба с алкохол, диета с високо съдържание на мазнини и диета с високо съдържание на холестерол. Междувременно преяждането или хроничната консумация на алкохол и диетата с високо съдържание на мазнини и холестерол са популярни тенденции в маниерите на обитаване на масата.

Тези открития намекнаха, че холестеролът и алкохолът могат да имат важни синергични ефекти върху развитието на FLD. И имаше малко изследвания, включващи механизма на това как алкохолът предизвиква по-тежък FLD синхронно с диетата на холестерола. Нашите цели бяха да определим дали и как алкохолът заедно с високия холестерол взаимодейства, за да предизвика по-тежък FLD. В това проучване мишките са хранени със стандартна течна диета на Либер-Декарли (LD), LD плюс 0,5% диета с холестерол, LD плюс 4% алкохолна диета или LD плюс 4% алкохол и 0,5% холестерол, за да имитират диетичните навици при хората и за изследване на ефекта от консумацията на алкохол върху метаболизма на холестерола, включително неговото усвояване, синтез и екскреция. Освен това, ние имахме за цел да проверим дали инхибирането на чревната абсорбция на холестерол, но не и усвояването на мазнини, захароза и алкохол в метаболизма на организма от Ezetimibe, може значително да подобри FLD при плъхове, хранени с високо съдържание на мазнини-холестерол-захароза и алкохол или не. Експерименталните процедури са показани на фигура 1.


2. Материали и методи

2.1. Материали и реактиви

Общ холестерол (TC), триглицериди (TG), липопротеинов холестерол с висока плътност (HDL-c), липопротеинов холестерол с ниска плътност (LDL-c), аланин трансаминаза (ALT), аспартат трансаминаза (AST) и фосфорна киселина трансаминаза (ALP) ) всички комплекти са закупени от Medical System Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, Zhejiang, China). Хематоксилинът, еозинът, Masson и Oil Red O са закупени от Nanjing Jiangcheng Technology Co., Ltd. (JiangSu, Китай). Антитела срещу тол-подобен рецептор 4 (TLR-4), ядрен фактор κB p65 (NF-κB p65), липопротеинов рецептор с ниска плътност (LDLR), активиран от пероксизомен пролифератор рецептор алфа (PPARα), транскрипционен фактор 2, свързващ стерол регулаторен елемент (SREBP2), транскрипционен фактор 1, свързващ стерол регулаторен елемент (SREBP1), 7-алфа хидрокси-лазе холестерол (CYP7A1), Niemann-Pick C1 Like 1 (NPC1L1), 3-хидрокси -3-метилглутарил-коензим А редуктаза (HMGCR), ATP-свързваща касета G8 (ABCG8), ATP-свързваща касета G5 (ABCG5) и GAPDH са закупени от Santa Cruz Biotechnology, САЩ. Антитела срещу рецептор на чистач тип В тип I (SR-BI) са от Abcam (Кеймбридж, САЩ). HRP конюгирани кози анти-заешки IgG (PV-6001) и HRP конюгирани кози анти-миши/заешки IgG (PV-6000) са от Zhongshan Goldenbridge Biotechnology Co.

2.2. Животни и експериментален дизайн

Четиридесет и осем специфични без патогени мъжки ICR мишки и тридесет мъжки SD плъхове са закупени от Академията за медицински науки в Zhejiang (Ханджоу, Китай); номерът на лиценза е SCXK (Zhe) 2014-0001. Съоръжението за настаняване е в съответствие с националните стандарти на GB14925-2010 (Лабораторни изисквания за животни за околна среда и жилищни съоръжения) за лаборатория. Грижите и експерименталната операция са били в съответствие с правилата на „Правило на администрацията на провинция Zhejiang за лабораторни животни“. Мишките бяха поставени по три на клетка във всяка група и хранени по двойки след една седмица на аклимация.

Мишките бяха разделени на случаен принцип в четири групи (n = 12) според теглото и след това като нормална LD група (NLG, хранене със стандартната течна диета на Lieber-DeCarli), холестеролна LD група (CLG, нормална LD плюс 0,5% холестерол (m/v)), Алкохолна LD група (ALG, 4% алкохолна LD (v/v)) и LD група холестерол и алкохол (CALG, 4% алкохол LD плюс 0,5% холестерол). Приготвя се хранителна съставка от диетата на Либер-ДеКарли (LD) и мишките се хранят по двойки, както описахме по-рано [10]. Калоричността на тези четири LD диети е една и съща (Таблица 1). Мишките в различни групи са били хранени със съответната диета в продължение на 5 седмици, за да създадат FLD модели. По време на експеримента бяха оценени телесното тегло и консумацията на калории.

SD плъховете първо бяха разделени на случаен принцип в 3 групи (

= 10) според теглото. Нормалната група (NG) е получавала стандартна диета с пелети и вода през първите 4 седмици от експеримента. Междувременно индуцираните от плъхове с високо съдържание на мазнини-холестерол-захароза и алкохол (ACHFCSD-) (MG и EG), както описахме по-рано [11], като се има предвид диетата с високо съдържание на мазнини и холестерол-захароза и пиенето на 22% алкохол-вода за първите 4 седмици от експеримента, имаше значително увеличение на ALT, AST и TC (данните не са показани). През следващите 12 седмици плъховете MG бяха определени като контролна група за модел и продължиха да получават високо съдържание на мазнини-холестерол-захароза и алкохол; EG плъховете получават високо съдържание на мазнини-холестерол-захароза, алкохол и езетимиб (в дози от 1 mg/kg, р.о.). По време на експеримента се оценява телесното тегло (данните не са показани).

В края на експериментите мишките и плъховете се гладуват цяла нощ и се получава кръв от офталмологичния венозен плексус. След това кръвта се центрофугира при 3500 rpm/min в продължение на 10 минути, за да се получи серум за биохимичен анализ. В края на експеримента мишките и плъховете бяха умъртвени чрез евтаназия и събрани чернодробни тъкани. Една част от черния дроб и тънките черва бяха поставени в 4% неутрален буфериран формалин и вградени в парафин за хематоксилин-и-еозин (H&E), имунохистохимия (IHC) или трихром на Masson’s (Masson). Останалата част от пресния дроб се замразява в течен азот и се съхранява при 80 ° C за оцветяване с Oil Red O и анализ на Western blot.

2.3. Определяне на серумни биомаркери

Серумният липиден профил на TC, TG, LDL-c и HDL-c и биомаркерите на чернодробната функция на ALT, AST и ALP бяха измерени със съответните набори от автоматичен биохимичен анализатор (TBA-40FR, Toshiba, Япония), както ние описано по-рано [11].

2.4. Чернодробна хистопатологична оценка чрез H&E, маслено червено O и оцветяване на Masson

Чернодробните сегменти бяха фиксирани в 4% неутрален буфериран разтвор на формалин за минимум 72 часа и вградени в парафинов восък. Вградените чернодробни тъкани бяха нарязани на 4 μm дебели секции и оцветени с H&E и Masson, както описахме по-рано [12, 13]. Извади малка част от чернодробните тъкани от -80 ° C и подготви замразения ОСТ за вграждане на черния дроб. Вградените чернодробни тъкани бяха нарязани на 8 μm дебелина при -20 ° C и след това се оцветява с Маслено червено O, както описахме по-рано [2, 10]. Всички оцветявания са снимани с биологичен микроскоп (BA410, Motic, Китай) и анализирани със софтуера Image-Pro Plus, за да се оцени отлагането на липиди, възпалението и лезията на фиброза.

2.5. Анализ на Western Blot

Уестърн петно ​​беше подобно, както описахме по-рано [14]. Накратко, 50

2.6. Имунохистохимия (IHC) Анализ на възли и възли на метаболизма на холестерола

Оцветяването с имунохистохимия (IHC) беше подобно, както описахме по-рано [12]. Приготвените парафинови чернодробни или тънки черва се справят с 3% H2O2 за предотвратяване и инактивиране на ендогенна каталаза за 10 минути при стайна температура. След това секциите трябваше да преминат през извличане на антиген с цитратна буферна течност (Beyotime, Jiangsu, Китай). Пробите реагираха с първично антитяло от TLR-4, LDLR, SR-BI, NPC1L1, PPARα, SREBP2, SREBP1, CYP7A1, ABCG8 и ABCG5 през нощта при 4 ° C. След това подходящите вторични антитела (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology Co., Пекин, Китай) бяха инкубирани в продължение на 30 минути при стайна температура. След DAB оцветяване ядрото се оцветява с хематоксилин и се запечатва с неутрални смоли. Положителното оцветяване представлява жълт или кафяв цвят под биологичния микроскоп. Данните за протеиновите експресии бяха полуколичествено анализирани като интегрирана опционна плътност (IOD) в положителна област на микрофотографията със софтуера Image-Pro Plus.

2.7. Статистически анализ

Всички стойности са изразени като средно ± стандартно отклонение. Данните бяха подложени на еднопосочен дисперсионен анализ. Разликите се считат за статистически значими, ако стойността на P е по-малка от 0,05. Всички анализи бяха извършени с помощта на софтуера SPSS версия 15.0.

3. Резултати

3.1. Алкохолът с диета с холестерол причинява по-малко наддаване на тегло, отколкото диетата с холестерол

Мишките на четирите диетични групи имат сходно изходно тегло (25,72 ± 2,13 g). До края на експеримента няма разлика в теглото на мишките между NLG и CLG. За разлика от това, мишките са натрупали по-малко тегло при ALG и CALG в сравнение с NLG (P
а)
б)
(° С)

Първоначално холестеролът се абсорбира в метаболизма на тялото в тънките черва чрез NPC1L1 [44]. Нашите резултати показаха, че богатата на холестерол диета самостоятелно или в комбинация с консумацията на алкохол също значително увеличава експресията NPC1L1 в тънките черва. Нещо повече, ние избрахме Ezetimibe, селективен инхибитор на NPC1L1 в лигавицата на тънките черва, и проверихме, че инхибирането на абсорбцията на чревния холестерол, но не и абсорбцията на мазнини, захароза и алкохол в метаболизма на тялото, може значително да подобри FLD при плъхове, хранени с високо съдържание на мазнини-холестерол-захароза и алкохол. Тези данни показват, че метаболизмът на холестерола заема важно място в FLD, предизвикан от холестерол и алкохол. Резултатите показват, че метаболизмът на холестерола играе важна роля в холестерола и алкохолно-индуцираната FLD.

Възможни са и допълнителни механизми, при които алкохолът може да стимулира възпаление на черния дроб. Потенциалните механизми включват, че алкохолът разрушава естествената бариера на червата и увеличава пропускливостта на чревната лигавица. В резултат LPS попада в ентерохепаталната циркулация, което води до активиране на TLR4/NF-κВ път в чернодробните клетки на Kupffer и предизвиква освобождаването на големи възпалителни фактори, които в крайна сметка водят до увреждане на черния дроб. При плъхове се предполага, че диетичният алкохол предизвиква активиране на клетките на Купфер, което води до възпалителен инфилтрат [45]. Освен това беше демонстрирано, че в нашите експерименти настройването на диета за алкохол и холестерол причинява повече възпалителен инфилтрат, отколкото само диета с алкохол или холестерол.

В заключение, диетата с холестерол, комбинирана с предизвикана от алкохол диета FLD, може да синтезира рисковите фактори за алкохолни и неалкохолни мастни чернодробни заболявания и да инхибира някои полезни механизми за регулиране на обратната връзка, за да ускори и влоши появата и развитието на FLD. Настоящото проучване демонстрира, че консумацията на алкохол, заедно с поглъщането на холестерол, предизвиква по-тежък FLD, като влияе на метаболизма на холестерола, което може да бъде свързано главно с влиянието на абсорбцията на холестерола (LDLR ↑ и NPC1L1 ↑), синтеза (PPARα↓, SREBP1/2 ↑ и HMGCR ↑) и екскреция (CYP7A1 ↓ и ABCG5/8 ↓) в черния дроб или тънките черва. Нашите открития могат да покажат, че комбинацията от консумация на алкохол и диета с висок холестерол за дълго време е много лоша, тъй като ще ускори развитието на FLD. Разследването на механизмите има определено значение за профилактиката и лечението на FLD. В бъдещите изследвания е необходимо използване на повече експериментални методи за валидиране на значително променените показатели и трябва да се вземат предвид повече животински модели и различно време за моделиране, за да се илюстрират разликите в някои показатели или с клиничните проби.

Наличност на данни

Данните, използвани в подкрепа на констатациите от това проучване, са достъпни от съответния автор при поискване.

Конфликт на интереси

Авторите декларират, че няма конфликт на интереси.

Приноси на авторите

Бо Ли и Шан-Шан Лей допринесоха еднакво за работата.

Благодарности

Това проучване беше подкрепено от Националната програма за ключови изследвания и развитие на Китай (2017YFC1702200 до Su-Hong Chen), Националната научна фондация на Китай (81673638 и 81874352 до Su-Hong Chen, 81873036 до Gui-Yuan Lv и 81803760 до Bo Li), ключовата програма за изследвания и развитие на провинция Zhejiang (2017C03052 до Gui-Yuan Lv и 2015C02032 до Su-Hong Chen) и Китайската фондация за докторантура (2018M632506 до Bo Li).

Допълнителни материали

Фигура S1: серумно ниво на TC на мишки, хранени с 4% алкохол и 0,5% LD холестерол след хранене 3 седмици и съдържание на TC в черния дроб след хранене 5 седмици. Серумен TC е открит с автоматичен биохимичен анализатор и съдържанието на TC в черния дроб е измерено чрез комплект за анализ на общия холестерол (закупен от Института по биоинженерия NanJing JianCheng) в съответствие с инструкциите. (Допълнителни материали)

Препратки