Резюме

Подозира се, че малкото тегло при раждане и излишъкът от ранен прием на протеини засилват по-късното затлъстяване. Настоящото проучване е предприето, за да се определи въздействието на диети, различни по съдържание на протеини, върху краткосрочния растеж, развитието на мастната тъкан и системата на инсулиноподобния растежен фактор (IGF) при прасенца. Прасенцата с нормално (NW) и малки (SW) тегло са хранени с заместители на мляко, формулирани да осигурят адекватно (AP) или високо протеиново (HP) снабдяване между 7 и 28 d възраст. Фракционният темп на растеж беше по-висок (стр

Сред различните фактори, които могат да допринесат за нарастването на разпространението на наднормено тегло и затлъстяване в света, ранното хранене получава все по-голямо внимание. Според концепцията за „метаболитно програмиране“ промяната в храненето в критичен период от развитието в ранния живот засяга последващия модел на растеж и развитие на тъканите и органите и може да предразположи индивидите към няколко нарушения в по-късния живот (1–3). Особено се счита, че такъв риск е доста висок за новородени, родени с малко тегло при раждане. Тези новородени често се хранят с формули, обогатени с протеини, за да насърчат догонващия растеж и развитието на мозъка. В този контекст някои автори повдигат хипотезата, че високият прием на протеини през ранния живот може да увеличи риска от последващо затлъстяване, вероятно чрез засягане на регулаторните оси (4,5). Въпреки това, докато някои епидемиологични проучвания са склонни да показват положителна връзка между съотношението между протеините и енергията в ранен живот и индекса на телесна маса в детска възраст (5,6), други проучвания не показват такава връзка (7,8).

Животинските модели са полезни за изясняване на този въпрос, който представлява голям интерес за храненето (9). Малкото налични данни за гризачи се основават на модулацията на приема на протеини на язовира, а не на потомството (10–12). Прасето може да бъде подходящ модел за проектиране на експерименти, занимаващи се както с теглото при раждане, така и с храненето на новороденото. При нормално хранените свине майки може да има до 3 пъти разлика в телесното тегло при кошарите, като по този начин се осигурява естествена форма на забавяне на вътрематочния растеж (IUGR; 13,14). В допълнение, този модел позволява изкуствено отглеждане и следователно дава възможност за модулация и контрол на приема на храна през неонаталния период. Следователно, настоящото проучване е предприето за оценка на краткосрочните ефекти на високия прием на протеин между 7 и 28-дневна възраст върху растежа и развитието на мастната тъкан при прасенца с нормално и малко тегло при раждане. Също така беше изследвано дали тази диета предизвиква промени в ендокринната система и особено в системата на инсулиноподобния растежен фактор (IGF), за която е известно, че играе важна роля в процесите, които свързват храненето и растежа (5,15).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни и експериментален дизайн.

Хранене на животни.

Прасенцата, хранени с формули, се настаняват поотделно в клетки за метаболизъм от неръждаема стомана в контролирано от температура помещение (30 ± 0,5 ° C) на възраст от 7 до 28 дни. Те бяха хранени с автоматична хранилка за мляко (фиг. 1), проектирана и сглобена в нашата лаборатория, за да достави предварително определено количество диета и да отчете консумацията на прасенца. Формулите се приготвят ежедневно, непрекъснато се разбъркват и се поддържат при 4 ° С в отделни хладилни кутии. При всяко хранене формулите се затоплят, за да се избегнат храносмилателни нарушения на прасенца. Ежедневните дажби за формули са изчислени в нетна енергия (NE) съгласно предварително дефинирана таблица за хранене въз основа на проучвания за производство на мляко (18). Дневният прием на NE на прасенца, хранени с формули, е 1300 kJ/kg телесно тегло 0,75 от 7 до 15 d възраст, прогресивно намалява до 940 kJ/kg телесно тегло 0,75 между 15 и 28 d възраст. Теглото на тялото се записва седмично. Дажбата беше разделена на осем хранения, автоматично разпределени между 0600 и 2130. Прасенцата имаха свободен достъп до вода само през нощта.

растежа

Автоматична хранилка за мляко.

AP диетата е формулирана така, че да съответства на състава на протеините, аминокиселините, мазнините и въглехидратите, както и на съотношението на казеин към разтворим суроватъчен протеин (46:54) в суровите вещества на суровото мляко. Средният състав на млякото на свинята, оценен между 7 и 22 дни лактация, е използван като референтен (Таблица 1, 19). HP прахът е формулиран така, че да осигурява повече аминокиселини на единица NE от праха AP. Протеиновата добавка е включена в частично заместване на непротеинови съставки, поддържайки постоянни както съотношението казеин към разтворимия суроватъчен протеин, така и съотношението мазнини към въглехидрати. Следователно, съотношението на протеин към NE е 46,5% по-високо в HP, отколкото в AP прах (Таблица 1).

Вземане на проби.

На 14 d възраст катетри се въвеждат в една външна яремна вена на всяко животно под обща анестезия. Разтвор на хепарин (50 UI/ml) във физиологичен разтвор се промива през ден през катетъра, за да се запази патентован през целия експериментален период. Кръвни проби се събират 1 час след хранене на всеки трети ден между 17 и 28 d възраст. На 28 d възраст прасенцата са заклани 3 часа след последното хранене в експерименталната кланица чрез електрическо зашеметяване и обезкръвяване. Взети са проби от мастна тъкан в рамките на 15 минути. За хистологичен анализ, тъканните проби бяха задържани върху плоски пръчки и замразени в 2-метилбутан, охладен с течен азот. За други измервания тъканите, нарязани на малки парчета, бяха замразени в течен азот. Всички тъканни проби се съхраняват при -75 ° C, а пробите от EDTA-плазма се съхраняват при -20 ° C за по-късни анализи.

Определяне на диаметъра на адипоцитите.

Диаметърът на адипоцитите беше определен в четири серийни напречни сечения (с дебелина 10 μm на интервал от 40 μm) замразени тъкани, нарязани с криостат (2800 Frigocut Reichert-Jung, Francheville, Франция). Напречните сечения бяха фиксирани за 10 минути в 100 mM фосфатен буфер (рН 7,4), съдържащ 2,5% глутаралдехид, и оцветени в продължение на 4 минути в изопропанол, съдържащ 0,5% маслено червено О. Отделни области на адипоцити бяха измерени с помощта на система за анализ на изображения (Optimas 6.5, Медийна кибернетика, Silver Spring, MD). Клетки с диаметър под 10 μm не бяха взети под внимание. Резултатите бяха средната стойност на определянията, извършени на четирите секции и бяха изразени като диаметър (μm) на видимите адипоцити. Коефициентът на вариация за диаметъра на клетката между четирите последователни участъка е 9,9%.

Анализи на хормони.

Всички проби бяха анализирани в рамките на един анализ. Концентрациите на плазмения IGF-I се определят с помощта на валидиран радиоимуноанализ (20), който използва рекомбинантен човешки IGF-I (GroPep, Adelaïde, Австралия). Коефициентите на вариация на интра-теста и междуопитите за плазмени проби със средна концентрация на IGF-I от 28 ng/ml са съответно 12% и 18%. Концентрациите на плазмен лептин бяха измерени с помощта на многовидов комплект за радиоимуноанализ (LINCO Research, St. Charles, MO), предварително одобрен за използване в свиня плазма (21). Модификацията на анализа включва удвояване на плазмената проба. Коефициентите на вариация на интра-теста и междуопитването за свинска плазмена проба със средна концентрация на лептин от 1,82 ng/ml са съответно 5% и 14%.

Western blond анализ на плазмени IGFBPs.

Анализът се извършва върху проби, събрани при клане. Плазмени проби (2 μL) се подлагат на SDS/PAGE при нередуциращи се условия с използване на 12,5% разделителен гел. След това протеините бяха прехвърлени върху нитроцелулозни мембрани (22). Накратко, петна се измиват и след това се инкубират с 90 000 cpm/mL 125 I-IGF-I в продължение на 2 часа при стайна температура. След обширно измиване, петна се изсушават и се излагат на Kodak X-Omat AR филм за 6-7 d при -75 ° C. Авторадиограмите бяха сканирани и относителните нива на инсулиноподобни свързващи протеини на растежен фактор (IGFBP) бяха количествено определени с процесор на изображения (Quantity One, V4, Bio-Rad, CA). За да се предотврати вариация гел-гел в оценката на IGFBP, различните групи за лечение бяха представени на всеки гел.

RT-PCR в реално време.

Съотношение = (2 -Δ C T мишена (проба - калибратор))/(2 -Δ C T 18S (проба - калибратор)) .

Статистически анализ.

Данните бяха анализирани с помощта на GLM процедурата на SAS (SAS Inst., Inc., Cary, NC). За прасенцата, заклани на 7 d възраст, моделът включва ефектите от постелята и теглото при раждане, които са тествани спрямо остатъчната средна квадратна грешка между двойки прасенца. За прасенца, хранени с адаптирано мляко и заклани на 28 d възраст, моделът позволява допълнително тестване на диета и диета чрез взаимодействие с теглото при раждане. За концентрациите на хормони средните стойности за всяко прасенце бяха взети предвид при анализа, тъй като нямаше значителен ефект от пробния ден върху плазмените концентрации, независимо от разглежданата група. Всички данни са представени като средни стойности ± SEM. Разликите бяха счетени за значителни при стр

РЕЗУЛТАТИ

Растеж и прием на фураж.

Абсолютният темп на растеж (наддаване на тегло/d) през експерименталния период е по-нисък (стр Таблица 3 Растеж и консумация на прасета от СЗ и ЮЗ, хранени с формули между 7 и 28 d възраст

Мастна тъкан.

Относителното тегло на периреналната мастна тъкан, изразено на kg телесно тегло, е по-ниско (стр Фигура 2

Плазмени хормони.

При 7-d прасенца, концентрации на плазмен IGF-I (27,7 ± 3,1 срещу 25,7 ± 3,4 ng/ml в NW и SW, съответно) и лептин (2,52 ± 0,19 срещу 2,45 ± 0,13 ng/ml в NW и SW, съответно) не са били засегнати от теглото при раждане. Диетата не повлиява плазмената концентрация на тези хормони при 28-дневни прасенца (Таблица 4). По отношение на IGFBP, относителните нива в плазмата не се влияят от теглото при раждане при 7-d-прасенца (данните не са показани) или от теглото при раждане или диетата при 28-d-прасенца (Таблица 4).

Експресия на гени в мастните тъкани.

В периреналната мастна тъкан на 7-дневни прасенца експресията на гена на инсулиновия рецептор е по-ниска (стр Фигура 3

При 7-d прасенца експресията на гени, кодиращи IGF-I и лептин, е по-ниска (стр Фигура 4

ДИСКУСИЯ

Доколкото ни е известно, настоящото проучване е първото, което оценява краткосрочните ефекти на приема на протеини и възможното взаимодействие между ранното протеиново хранене и теглото при раждане върху растежа и развитието на мастната тъкан при новородени животни, отглеждани в добре контролирана среда. Малко малко други експериментални проучвания, проведени при гризачи, са изследвали въздействието на майчиното хранене през сучещия период, а не влиянието на съдържанието на млечен протеин (10–12). Ние показахме, че теглото при раждане влияе върху растежа на прасенца, развитието на периреналната мастна тъкан и някои компоненти на ендокринната система и че високият прием на протеини намалява масата на периреналната мастна тъкан без никакъв ясен ефект върху регулаторните оси или върху експресията на гени, свързани с липидния метаболизъм с изключение на гена FAS.

Използването на изкуствено отгледани прасенца ни позволи да оценим въздействието на ранния прием на протеини. Тъй като прасенцата, хранени с диетите AP и HP, консумират същото количество енергия, разликите, наблюдавани между прасенца, хранени с двете диети, се дължат на вариация в съотношението протеин/енергия. Нашите резултати показват, че прасенцата AP и HP от двете групи с тегло при раждане показват сходен темп на растеж между 7 и 28 d възраст. Въпреки че често се смята, че високият прием на протеини може да предизвика наваксващ растеж при индивиди с ниско тегло при раждане, не сме открили доказателства за такъв ефект през разглеждания период. Както предлага Дейвис и др. (31), възможно е SW прасенцата да не могат да покажат догонващ растеж, тъй като може да са били недохранени през цялата бременност. Възможно е също така разследваният период да е твърде кратък. В действителност е доказано, че увеличаването на приема на протеини за по-голяма продължителност (от 1,8 до 15 kg телесно тегло) увеличава наддаването на тегло при прасетата (24).

В обобщение, настоящата работа показва, че теглото при раждане е повлияло развитието на периреналната мастна тъкан и подкрепя компенсаторното развитие на тази тъкан при SW прасенца. Това също така показва, че високият прием на протеини намалява затлъстяването и в двете групи с тегло при раждане, поне на периненалното ниво през неонаталния период. Необходими са допълнителни проучвания, за да се оцени дали прасенцата, хранени с такава диета през ранния период от живота, ще останат впоследствие с намалена телесна мастна маса или не.

Съкращения

адипоцитен (А) тип свързващ протеин на мастни киселини