Резюме

  • 11βHSD, 11β-хидроксистероидна дехидрогеназа
  • 11DHC, 11-дехидрокортикостерон
  • aP2, адипоцитен свързващ протеин на мастни киселини
  • НЕТ, кафява мастна тъкан
  • DEXA, двуенергийна рентгенова абсорбциометрия
  • GC, глюкокортикоид
  • GR, GC рецептор
  • HFD, диета с високо съдържание на мазнини
  • ISWAT, интраскапуларна бяла мастна тъкан
  • МАТ, мезентериална мастна тъкан
  • PGAT, перигонадна мастна тъкан
  • SCAT, подкожна мастна тъкан
  • WT, див тип

Глюкокортикоидите (GC) играят критична роля в множество метаболитни процеси, включително хомеостаза на глюкозата, инсулинова чувствителност, липиден метаболизъм и адипогенеза. Излишъкът от GC, независимо дали е ендогенен (синдром на Кушинг) или екзогенен, насърчава висцералното затлъстяване, инсулиновата резистентност, дислипидемията и хипертонията (1). Подобно съзвездие на метаболитни аномалии е свързано с идиопатично затлъстяване и определя много по-разпространения метаболитен синдром (1,2). Въпреки че са наблюдавани фини промени в оста хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза при идиопатично затлъстяване и метаболитен синдром, не е установена ясна роля за увеличените циркулиращи ГК (3).

инактивация

Действието на GC в прицелните тъкани обаче зависи не само от концентрациите на циркулиращия GC и експресията на клетъчния GC рецептор (GR), но и от тъканно специфичния вътреклетъчен метаболизъм на GC от 11β-хидроксистероидни дехидрогенази (11βHSD) (4). 11βHSDs действат на ниво рецептор, за да катализират взаимното превръщане на хормонално активни 11β-хидроксилирани GC (кортизол при хора и кортикостерон при мишки) и техните хормонално неактивни 11β-кето метаболити (кортизон при хора и 11-дехидрокортикостерон [11DHC] при мишки) (5 ). Идентифицирани са две изоформи на 11βHSD. 11βHSD1 е ниско афинитетна NADPH-зависима редуктаза, експресирана главно в GC целеви тъкани, като черен дроб, мастна тъкан и централната нервна система, където усилва локалното GC действие. 11βHSD2 е високоафинитетна NAD-зависима дехидрогеназа, експресирана главно в минералокортикоидни прицелни тъкани, като бъбреци, където мощно намалява локалното GC действие, като по този начин гарантира, че само несубстратният алдостерон има достъп до присъщи неселективни минералокортикоидни рецептори.

Бързо се натрупват доказателства в подкрепа на ролята на 11βHSD1 в патогенезата на висцералното затлъстяване и метаболитния синдром. 11βHSD1 се намалява в черния дроб и се засилва в мезентериалната мастна тъкан (MAT) при няколко модела на затлъстяване на гризачи, включително резистентни на лептин Lepr fa/Lepr fa плъхове (8,9) и лептинодефицитни Lep ob/Lep ob мишки (10). Няколко проучвания показват, че активността и експресията на 11βHSD1 в подкожната мастна тъкан (SCAT) са положително корелирани със затлъстяването и инсулиновата резистентност както при мъжете, така и при жените (11-17). В допълнение, полиморфната вариабилност в локуса 11βHSD1 е свързана с повишено съотношение между талията и ханша при възрастни (18) и с телесния състав и инсулиновата резистентност при децата (19).

Като такъв, 11βHSD1 е предложен като нова терапевтична цел за лечение на затлъстяване и метаболитен синдром. В действителност, фармакологичното инхибиране на 11βHSD1 при затлъстели гризачи подобрява глюкозния толеранс, инсулиновата чувствителност и липидните профили (20–22). Докато такова лечение е свързано с промени в експресията на чернодробни гени, мастната тъкан не е била изследвана (20,21). По подобен начин мишките с целенасочено разрушаване на 11βHSD1 във всички тъкани са намалили наддаването на тегло при диета с високо съдържание на мазнини (HFD), отслабили глюконеогенния отговор на гладно, подобрили глюкозния толеранс и инсулиновата чувствителност и атеропротективните липидни профили, въпреки че имат умерено повишени серумни нива на кортикостерон ( 23–25). Този благоприятен метаболитен фенотип е свързан с подобрени метаболитни функции, свързани с GC, както в черния дроб (24), така и в мастната тъкан (25). Независимо от това, както фармакологичното инхибиране, така и целевата генна делеция на 11βHSD1 засягат всички тъкани и следователно относителният принос на всяка отделна тъкан към общия метаболитен фенотип е неясен.

Моделите на трансгенни мишки предоставят представа за ролята на 11βHSD1 в отделните тъкани. Мишки със специфична за адипоцитите свръхекспресия на 11βHSD1, задвижвани от миши адипоцитен свързващ протеин за мастни киселини (aP2), развиват висцерално затлъстяване и метаболитен синдром (10,26). За разлика от това, мишките със специфична за черния дроб свръхекспресия на 11βHSD1, задвижвани от промотора на човешкия аполипопротеин Е, развиват инсулинова резистентност, дислипидемия и хипертония без затлъстяване (27). Тези данни предполагат, че GC усилването в мастната тъкан, повече от черния дроб, допринася за цялостния енергиен баланс. Не е известно дали 11βHSD1 в мастната тъкан допринася за другите характеристики на метаболитния синдром, независимо от черния дроб. Освен това фенотипните последици от инхибирането или липсата на регенерация на GC чрез 11βHSD1 изключително в мастната тъкан не са изследвани.

Ние предположихме, че намаляването на активните GCs изключително в мастната тъкан е важен фактор, определящ благоприятния метаболитен фенотип по отношение на енергийната хомеостаза и характеристиките на метаболитния синдром. За да тестваме тази хипотеза, генерирахме животински модел на специфична за адипоцитите GC инактивация чрез ектопична свръхекспресия на h11βHSD2 под контрола на мишият промотор на аР2.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Генериране на aP2-h11βHSD2 конструкция и трансгенни мишки.

Фрагмент от 5.4 kb, съответстващ на позиция -5.4 до +21 на миши aP2 промотор (предоставен от BM Spiegelman), се лигира на 1.9 kb фрагмент, съответстващ на позиция -133 до +1.764 от човешка плацентарна 11βHSD2 cDNA, включително нейното естествено полиаденилиране сигнал (28,29). Линеаризираната 7.3-kb конструкция NotI-SalI aP2-h11βHSD2 се инжектира в пронуклеуси на оплодени зиготи от FVB мишки и се прехвърля на псевдо бременни женски. Потомците бяха скринирани за геномна интеграция чрез PCR на опашната ДНК, като се използват следните h11βHSD2-специфични праймери: напред 5′-CGGCCGTGGCGCTACTCAT, обратен 5′-GGGAAGGGCCGGGCTCAGGTTT.

Екстракция на РНК и анализ на генната експресия.

11βHSD1 и 11βHSD2 активност.

Дейностите бяха анализирани, както е описано по-горе (28,30). Активността на 11βHSD2 дехидрогеназа се определя чрез измерване на процентното превръщане на тритиран кортикостерон (10 nmol/l) в 11DHC в присъствието на излишък (400 μmol/l) ензимно-специфичен кофактор (NAD + за 11βHSD2 и NADPH за 11βHSD1). Реакциите съдържаха 0,1 mg/ml протеин с инкубационно време от 10 минути. Активността на 11βHSD1 редуктаза се определя по същия начин, като се използва тритиран 11DHC като субстрат, но с 0,2 mg/ml протеин и 30-минутна инкубация. Концентрацията на протеини и времето на инкубация бяха оптимизирани така, че активността да беше в линейния диапазон за образуване на продукта. Реакциите се провеждат в два екземпляра с празни анализи, протичащи паралелно. Стероидите се екстрахират с етилацетат, разделят се чрез тънкослойна хроматография, идентифицират се чрез миграция в сравнение с известните стандарти и се определят количествено с фосфомагерен тритиев екран (Fuji).

Анализ на кръвта.

Плазмената глюкоза се определя с помощта на One Touch FastTake глюкометър (LifeScan). Серумният инсулин се определя от Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit (CrystalChem). Серумният кортикостерон се определя чрез комплект за радиоимуноанализ на плъхове за кортикостерон (ICN Pharmaceuticals).

Статистически анализ.

Данните са изразени като средни стойности ± SE. Сравненията между групите бяха направени чрез несдвоени двустранни t-тестове на Student или чрез едно- или двупосочен ANOVA, според случая с генотип и/или диета като променливи. Там, където са открити разлики от ANOVA, са извършени множество сравнителни тестове за Tukey. За надлъжно телесно тегло и тестове за толерантност към глюкоза и инсулин бяха направени сравнения чрез двупосочна ANOVA с повтарящи се мерки. За данните за енергийните разходи бяха направени сравнения, използвайки анализ на смесен модел.

РЕЗУЛТАТИ

Експресията и активността на 11βHSD2 се повишава изключително в мастната тъкан на трансгенни мишки.

Трансгенните мишки са жизнеспособни и плодородни с потомство в очакваните съотношения на Мендел. Тъй като ендогенният 11βHSD2 в бъбреците е достатъчен, за да инактивира напълно кортикостерона в тази тъкан, целта е да се създадат трансгенни мишки с миши нива на h11βHSD2 в бъбреците в мастната тъкан. Данните са показани от представителна линия (фиг. 1). Трансгенът h11βHSD2 се експресира във всички депа на мастна тъкан на трансгенни мишки, включително SCAT, MAT, перигонадна мастна тъкан (PGAT), периренална плюс ретроперитонеална мастна тъкан (PRRP), интраскапуларна бяла мастна тъкан (ISWAT) и кафява мастна тъкан (BAT) ( Фиг. 1А). Относителната експресия на h11βHSD2 е значително по-голяма от ендогенната m11βHSD1 експресия, като съотношението на h11βHSD2 към m11βHSD1 експресия в SCAT е съответно 2,55 ± 0,65 и 12,74 ± 4,84 при хранени с чау и HFD мишки. Експресията на h11βHSD2 липсва в неадипозни тъкани на трансгенни мишки, включително цял мозък, скелетни мускули, черен дроб и бъбреци, а също така липсва във всички горепосочени тъкани на WT мишки (данните не са показани).

По същия начин, активността на 11βHSD2 беше открита във всички депа на мастна тъкан на трансгенни мишки (фиг. 1В). Активността на 11βHSD2 при трансгенни мишки, изразена като процентна активност в миши бъбрек, е както следва: трансгенна чау: SCAT 137,73%, BAT 111,35%, PGAT 139,16%, ISWAT 152,72% и MAT 52,74%; трансгенен-HFD: SCAT 246,12%, НДНТ 87,18%, PGAT 155,36%, ISWAT 168,44% и MAT 49,74%. Активността на 11βHSD2 е значително по-висока при трансгенни в сравнение с WT мишки (фиг. 1С). Докато ендогенен 11βHSD2 не е докладван в адипоцити сам по себе си, са докладвани ниски нива в съдовия ендотел (31). Експресията на ендогенния m11βHSD2, за разлика от h11βHSD2 трансгена, е изключително ниска спрямо миши бъбреци и не се различава между генотипите на дадена диета (m11βHSD2/18S за WT-chow 0,007 ± 0,002, трансгенна-chow 0,009 ± 0,002, WT- HFD 0,015 ± 0,002 и трансгенно-HFD 0,014 ± 0,002), което предполага, че разликата в активността на 11βHSD2 може да се отдаде на трансгена h11βHSD2, а не на ендогенен m11βHSD2.

Други детерминанти на действието на GC и системните индекси на експозиция на GC не се различават между трансгенни и WT мишки.

Експресията на 11βHSD1 (Таблица 1) и активността (Фиг. 1D) в SCAT са сходни между WT и трансгенни мишки. И за двата генотипа експресията и активността на 11βHSD1 са намалени при мишки на HFD в сравнение с диетата с чау, в съответствие с публикувани по-рано данни, показващи понижаване на регулацията на 11βHSD1 от HFD при мишки (32). Експресията на GRα (Таблица 1) в SCAT не се повлиява значително от генотипа или диетата. В допълнение, серумният кортикостерон и различни индекси на системна експозиция на GC, включително тегло на тимуса, надбъбречно тегло, костна плътност, чиста телесна маса и назоанална дължина, също са сходни между WT и трансгенни мишки (Таблица 2).

Трансгенните aP2-h11βHSD2 мишки се противопоставят на увеличаване на теглото при HFD.

Мишките и с двата генотипа, хранени с HFD, са натрупали значително повече тегло от мишките, хранени с чау-диета (телесно тегло на 24 седмици: WT-chow 32,87 ± 0,54 g, трансгенно-чау 32,82 ± 0,52 g, WT-HFD 44,52 ± 0,66 g и трансгенно-HFD 40,80 ± 1,04 g). Телесното тегло за WT и трансгенни мишки, хранени с чау диета, са сходни през цялото 24-седмично проучване. За разлика от това, трансгенните мишки, хранени с HFD, са спечелили значително по-малко тегло, отколкото WT мишките, хранени с HFD (фиг. 2).

Трансгенните мишки aP2-h11βHSD2 на HFD имат намалена телесна мазнина.

Процентната мастна маса от DEXA (фиг. 3А) се увеличава при мишки от двата генотипа, хранени с HFD, в сравнение с мишки, хранени с диу чау (WT-чау 20,56 ± 0,57%, трансгенна чау 20,78 ± 0,82%, WT-HFD 37,78 ± 0,75%, и трансгенен-HFD 34,11 ± 1,21%). Процентът мастна маса от DEXA е сходен между WT и трансгенните мишки, хранени с диета. За разлика от това, трансгенните мишки, хранени с HFD, имат значително по-нисък процент мастна маса от WT мишките, хранени с HFD. Чистата телесна маса от DEXA и линейният растеж не се различават съществено между генотипите на нито една от диетите (Таблица 2). Общото тегло на мастната тъкан (фиг. 3В) се увеличава при мишки от двата генотипа, хранени с HFD, в сравнение с мишки, хранени с диу чау (общо тегло на мазнини: WT-chow 2,70 ± 0,12 g, трансгенно-чау 2,93 ± 0,28 g, WT-HFD 7,38 ± 0,43 g и трансгенен-HFD 5,51 ± 0,55 g). Общото тегло на мастните подложки е сходно при WT и при трансгенните мишки, хранени с диета. За разлика от това, трансгенните мишки, хранени с HFD, имат значително по-ниско общо тегло на мастна тъкан, отколкото WT мишки, хранени с HFD. Тази разлика в общото тегло на мастната подложка се дължи главно на намаленото тегло на мастните накладки на депото SCAT и в по-малка степен на периреналните плюс ретроперитонеалната мастна тъкан и депата ISWAT (фиг. 3С).

Трансгенните мишки aP2-h11βHSD2 имат намален прием на храна и увеличен разход на енергия.

Средният дневен (фиг. 4А) и кумулативният (фиг. 4Б) прием на храна са по-ниски при трансгенни в сравнение с WT мишки на HFD (среден дневен прием на храна за WT-HFD 5,95 ± 0,25 g спрямо трансгенен-HFD 5,21 ± 0,23 g; кумулативен прием на храна за WT-HFD 71.40 ± 2.95 g спрямо трансгенен-HFD 62.50 ± 2.80 g). В допълнение, консумацията на кислород (V o 2) е значително увеличена при трансгенни в сравнение с WT мишки (WT-HFD 3,016 ± 34 mg · ml −1 · h −1 спрямо трансгенна-HFD 3,238 ± 34 mg · ml −1 · h -1) (Фиг. 4C). Това повишаване на консумацията на кислород при трансгенни мишки е налице през 24-часовия цикъл за всеки ден по време на периода на изследване (Фиг. 4D).

Трансгенните мишки aP2-h11βHSD2 имат подобрен глюкозен толеранс и инсулинова чувствителност.

Плазмената глюкоза на гладно (фиг. 5А) е по-висока при WT мишки, хранени с HFD, в сравнение с WT мишки, хранени с диу чау, но не се различава между трансгенни мишки, хранени с HFD, в сравнение с трансгенни мишки, хранени с диета с чау (WT-chow 134 ± 7 mg/dl, WT -HFD 155 ± 5 mg/dl; трансгенен-чау 137 ± 5 mg/dl, трансгенен-HFD 148 ± 6 mg/dl). Плазмената глюкоза на гладно не се различава значително между WT и трансгенните мишки на нито една от диетите. Серумният инсулин на гладно (фиг. 5В) е по-висок при WT мишки, хранени с HFD, в сравнение с WT мишки, хранени с диу чау, но не се различава между трансгенни мишки, хранени с HFD, в сравнение с трансгенни мишки, хранени с чау диета (WT-chow 0,4190 ± 0,0336 ng/ml, WT -HFD 0,7331 ± 0,0886 ng/ml; трансгенна-чау 0,2893 ± 0,0285 ng/ml, трансгенна-HFD 0,4350 ± 0,0759 ng/ml). Серумният инсулин на гладно е значително по-нисък при трансгенни в сравнение с WT мишки и при двете диети.

Глюкозният толеранс чрез тест за толерантност към глюкоза (фиг. 5С) е бил нарушен при WT мишки, хранени с HFD, в сравнение с WT мишки, хранени с диета, но е подобен при трансгенни мишки, хранени с HFD, спрямо трансгенни мишки, хранени с диета. Глюкозният толеранс е подобен между трансгенните и WT мишките, хранени с диу чау. Глюкозният толеранс при трансгенни мишки, хранени с HFD, беше подобрен в сравнение с WT мишки, хранени с HFD, и подобен на глюкозния толеранс на мишки от двата генотипа, хранени с чау диета. Инсулиновата чувствителност чрез тест за толерантност към инсулин (фиг. 5D) е намалена при WT мишки, хранени с HFD, в сравнение с WT мишки, хранени с диета, но е подобна при трансгенни мишки, хранени с HFD, в сравнение с трансгенни мишки, хранени с чау диета. Инсулиновата чувствителност е сходна между трансгенните и WT мишките, хранени с диу чау. Инсулиновата чувствителност при трансгенни мишки, хранени с HFD, е подобрена в сравнение с WT мишки, хранени с HFD (първоначален декремент: WT-HFD +6,3 ± 5,1, трансгенна-чау -7,8 ± 3,4 mg/dl) и подобна на инсулиновата чувствителност на мишки от двата генотипа, хранени с чау диета.

Трансгенните мишки aP2-h11βHSD2 имат благоприятен профил на генна експресия на мастна тъкан.

За да се оценят молекулните механизми, залегнали в основата на този подобрен метаболитен профил, беше оценена експресията на гени, за които е известно, че играят важна роля в метаболизма на мастната тъкан и/или за които е известно, че се регулират от GC (Таблица 1). В SCAT на трансгенни в сравнение с WT мишки, хранени с HFD, експресията на разтворима фосфенолпируват карбоксикиназа, адипонектин, активиран от пероксизома пролифератор рецептор γ и разединяващ протеин 2 значително се увеличава, докато експресията на лептин и резистин значително намалява. Експресията на фактор на туморна некроза-α също е намалена в SCAT на трансгенни в сравнение с WT мишки, хранени с HFD, макар и не значително. Не са наблюдавани значителни разлики в експресията на гена на мастната тъкан при трансгенни в сравнение с WT мишки, хранени с чау диета.

ДИСКУСИЯ

Ние описваме животински модел на специфична за адипоцитите инактивация на GC чрез ектопична трансгенна свръхекспресия на h11βHSD2 под контрола на мишият промотор на аР2. 11βHSD2 намалява действието на GC in vivo, като катализира еднопосочното превръщане на хормонално активни 11β-хидроксилирани GCs в техните хормонално неактивни 11β-кето метаболити. Тъй като 11βHSD2 не се експресира ендогенно в адипоцити, трансгенната свръхекспресия на 11βHSD2 под контрола на aP2 промотора осигурява нов механизъм, чрез който GC действието може да бъде селективно намалено в мастната тъкан, като по този начин се обръща GC-усилващия ефект на ендогенния 11βHSD1. Подобен подход, използващ ектопична свръхекспресия на 11βHSD2 за тъкан, е използван за генериране на животински модел на намалено действие на GC в хипокампалните неврони за изследване на пътищата за реакция на невронния стрес (33).

Фенотипното характеризиране на трансгенни мишки aP2-h11βHSD2 разкрива няколко прилики с мишки с дефицит на 11βHSD1 (23-25). И двата модела демонстрират подобрен метаболитен отговор на HFD, характеризиращ се с резистентност към индуцирано затлъстяване, намалена мастна маса и подобрен глюкозен толеранс и инсулинова чувствителност (23-25). В допълнение, и двата модела имат намалена експресия на лептин и резистин и увеличена експресия на адипонектин, активиран от пероксизомен пролифератор рецептор γ и разединяване на протеин 2 в мастната тъкан (25). Потенциалният принос на тези гени към фенотипа е обсъден подробно другаде (25). Следователно тези прилики предполагат, че промененият метаболизъм на GC в мастната тъкан е основен фактор за тези аспекти на метаболитния фенотип.

В обобщение, специфичната за адипоцитите трансгенна свръхекспресия на h11βHSD2 е използвана като стратегия за определяне на ролята на специфичното за адипоцитите действие на GC в системния енергиен баланс. Трансгенните мишки aP2-h11βHSD2, хранени с HFD, показват резистентност към индуцирано от диетата затлъстяване, намалена мастна маса, намален прием на храна, увеличен разход на енергия и подобрен глюкозен толеранс и чувствителност към инсулин. Този метаболитен фенотип е свързан с намалена експресия на лептин и резистин и повишена експресия на адипонектин, активиран от пероксизома пролифератор рецептор γ и разединяване на протеин 2 в мастната тъкан. Тези данни предоставят първите in vivo доказателства, че намаляването на активните GCs изключително в мастната тъкан е важен фактор, определящ благоприятния метаболитен фенотип по отношение на енергийната хомеостаза и метаболитния синдром. По-нататъшното изследване на този модел може да помогне за идентифицирането на нови адипоцитни медиатори на системния енергиен баланс.