Вижте всички скриване на автори и принадлежности

червеи

  • Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за Е. М. Карейра
  • За кореспонденция: gertsch @ ibmm.unibe.chcarreira @ org.chem.ethz.ch
  • Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за J. Gertsch
  • За кореспонденция: gertsch @ ibmm.unibe.chcarreira @ org.chem.ethz.ch

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

И двата канабиноида действат като частични агонисти на CB1 рецепторите in vitro и in vivo. Ма, мега-годишно. Снимка: S. Fischer (D-CHAB, LOC, ETH Zurich).

  • Изтеглете изображение с висока разделителна способност
  • Отваряне в нов раздел
  • Изтеглете Powerpoint

И двата канабиноида действат като частични агонисти на CB1 рецепторите in vitro и in vivo. Ма, мега-годишно. Снимка: S. Fischer (D-CHAB, LOC, ETH Zurich).

Реактиви и условия: а) 1,0 еквивалента 1, 3,0 екв 2, 3 mol% [2], 12 mol% (S) -L, 15 mol% (S) - или (R)-A, 5 mol% Zn (OTf) 2, 1,2-дихлороетан (0,5 M), 25 ° C, 20 часа, за (S, R)-3: 59% добив,> 20: 1 диастереомерно съотношение (d.r.),> 99% енантиомерен излишък (т.е.), за (R, R)-3: 76% добив,> 12: 1 d.r.,> 99% e.e .; (b) 5 mol% Grubbs II кат., CH2Cl2, 25 ° C, 16 часа; (c) 2,3 еквивалента NaClO2, 2,0 еквивалента NaH2PO4, 30 еквивалента 2-метил-2-бутен, tert-BuOH/H2O, 25 ° C; след това 2,0 еквивалента Me3SiCHN2, C6H6/MeOH, 0 ° С, 90 минути; (d) 8,0 екв. КОН, 3,9 екв. И2, МеОН, 0 ° С, 45 минути; (д) 4,0 еквивалента MeMgBr, THF, 25 ° C, за (S, R)-4: 56% добив за три стъпки, за (R, R)-4: 56% добив за три стъпки; вижте допълнителните материали за конструкции от (S)-L, (С)-A, и (R)-A, както и за допълнителни подробности.

  • Изтеглете изображение с висока разделителна способност
  • Отваряне в нов раздел
  • Изтеглете Powerpoint

Реактиви и условия: а) 1,0 еквивалента 1, 3,0 екв 2, 3 mol% [2], 12 mol% (S) -L, 15 mol% (S) - или (R)-A, 5 mol% Zn (OTf) 2, 1,2-дихлороетан (0,5 M), 25 ° C, 20 часа, за (S, R)-3: 59% добив,> 20: 1 диастереомерно съотношение (d.r.),> 99% енантиомерен излишък (т.е.), за (R, R)-3: 76% добив,> 12: 1 d.r.,> 99% e.e .; (b) 5 mol% Grubbs II кат., CH2Cl2, 25 ° C, 16 часа; (c) 2,3 еквивалента NaClO2, 2,0 еквивалента NaH2PO4, 30 еквивалента 2-метил-2-бутен, tert-BuOH/H2O, 25 ° C; след това 2,0 еквивалента Me3SiCHN2, C6H6/MeOH, 0 ° С, 90 минути; (d) 8,0 екв. КОН, 3,9 екв. I2, МеОН, 0 ° С, 45 минути; (д) 4,0 еквивалента MeMgBr, THF, 25 ° C, за (S, R)-4: 56% добив за три стъпки, за (R, R)-4: 56% добив за три стъпки; вижте допълнителните материали за конструкции от (S)-L, (С)-A, и (R)-A, както и за допълнителни подробности.

Реактиви и условия: (f) 1,6 еквивалента KHMDS, THF, 65 ° C, 15 часа, за (S, R)-5: 78% добив, (R, R)-5: 82% добив; (g) 10,0 или 20,0 еквивалента NaSEt, DMF, 140 ° C, 16 часа, за (-) - cis-PET: 80% добив, (-) - транс-PET: 83% добив.

  • Изтеглете изображение с висока разделителна способност
  • Отваряне в нов раздел
  • Изтеглете Powerpoint

Реактиви и условия: (f) 1,6 еквивалента KHMDS, THF, 65 ° C, 15 часа, за (S, R)-5: 78% добив, (R, R)-5: 82% добив; (g) 10,0 или 20,0 еквивалента NaSEt, DMF, 140 ° C, 16 часа, за (-) - cis-PET: 80% добив, (-) - транс-PET: 83% добив.

РЕЗУЛТАТИ

Общ стереодивергентен синтез на цис- и транс-PET

Преди това въведохме стереодивергентна катализа, за да дадем възможност за синтеза на всички стереоизомери на мишена, като я прилагаме към синтеза на Δ 9-THCs (11–13). Поддържайки тази стереодивергентна стъпка, стратегията беше адаптирана да синтезира достатъчно количество PETs за биологични тестове и разчиташе на SNAr циклизация за сглобяване на ядрото на дихидробензопиран (15). След стереодивергентна стъпка с използване на катализирано от иридий и амин алдехидно алилиране (1 + 2 → 3), предшествениците на SNAr 4 бяха получени чрез метатеза за затваряне на пръстена, окислителна естерификация и последващо добавяне на Гринярд (Фиг. 2). Резултатът от решаващата циклизация на SNAr беше силно зависим от избора на база; при реакции с LiHMDS и NaHMDS субстратът се оказа нереактивен, с пълно възстановяване на изходния материал след 16 часа в кипящ тетрахидрофуран (THF). Използването на KHMDS при иначе идентични условия доведе до образуването на (S, R)-5 и (R, R)-5 с висок добив (фиг. 3). И накрая, деметилирането с натриев етантиолат в N, N'-диметилформамид (DMF) при 140 ° C дава (-) - цис-PET и (-) - транс-PET.

In vitro фармакология на PET и Δ 9-THC изомери върху канабиноидни рецептори и ендоканабиноидни разграждащи ензими

Стойностите на Emax представляват максималното [35 S] GTPγS свързване, изразено като процент от третираната с носител проба (100%). „Пълен“ и „частичен“ в скоби означават пълен и частичен агонист.

In vivo фармакология на цис- и транс-PET

Потенциалните канабимиметични ефекти на PET диастереоизомерите бяха оценени in vivo в батерия от четири теста, обикновено свързани с активиране на CB1R при мишки (хипотермия, каталепсия, хиполокомоция и аналгезия), наричани общо „тетрада“ (14). Експерименти с използване на различни (т.е. еквипотентни на Δ 9-транс-ТНС) дози показват, че cis-PET (50 mg/kg) и транс-PET (40 mg/kg) предизвикват пълната тетрада в мишки BALB/c при интраперитонеално инжектиране ( Фиг. 4). Степента на хипотермия, каталепсия, хиполокомоция и аналгезия е в същия диапазон, както се наблюдава при Δ 9-транс-ТНС в доза 10 mg/kg, в съгласие с различните потенции, измерени in vitro за CB1R активиране. Фармакологичните ефекти на PET и THC диастереоизомерите бяха премахнати изцяло чрез предварителна обработка с CB1 рецепторен антагонист римонабант (SR1) при 5 mg/kg, което показва, че тетрадът зависи от активирането на CB1 рецептора в мозъка.

  • Изтеглете изображение с висока разделителна способност
  • Отваряне в нов раздел
  • Изтеглете Powerpoint

(A) Хипотермия, (Б.) каталепсия, (° С) хиполокомоция и (д) аналгезия, предизвикана от Δ 9-транс-THC (червено), cis-PET (зелено) и транс-PET (синьо) в сравнение с контрола на носителя (бяло) при BALB/c мъжки мишки 1 час след интраперитонеално инжектиране. Фармакологичните ефекти са напълно блокирани от CB1 рецепторния антагонист римонабант (SR1, сиви колони). Дозите са изразени в mg/kg. Данните показват ± SD. Групите бяха сравнени с третираната с носител контролна група, използвайки еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) след post hoc тест на Tukey, n = 5 до 15 мишки на група. *** Р

LC-MS/MS количествено определяне на нивата на цис- и транс-перротетинен PET, ендоканабиноиди, простагландини и арахидонова киселина в мозъка на мишка

  • Изтеглете изображение с висока разделителна способност
  • Отваряне в нов раздел
  • Изтеглете Powerpoint

LC-MS/MS количествено определяне на (A) Δ 9-транс-THC (червен), cis-PET (зелен) и транс-PET (син); (Б.) AEA; (° С) 2-AG; (д) AA; (Е.) PGD2; и (F) PGE2 в мозъка на мъжки мишки BALB/c 1 час след интраперитонеална инжекция. Ефектите на PET диастереоизомери върху PGD2 и PGE2 бяха инхибирани от CB1 рецепторния антагонист римонабант (SR1). Дозите са изразени в mg/kg. Данните показват ± SD. Групите бяха сравнени с третираната с носител контролна група, като се използва еднопосочен ANOVA след post hoc тест на Tukey n = 5 до 15 мишки на група. ** Р

cis-PET фармакология върху основни цели на ЦНС

Данните показват процента на свързваща или протеинова активност (ензим, транспортер и йонни канали) при тестови концентрации от 10 μM (cis-PET, синя линия) и 1 μM (cis-PET, оранжева линия; Δ 9 -trans-THC, зелена линия). Представените данни се получават от два независими експеримента, всеки от които се извършва в два екземпляра. За пълни имена на съкращения вижте допълнителните материали. 100% е предназначен за пълна ензимна активност (ензими), транспорт на субстрат (мембранен транспортер), свързване с рецептори (GPCR и ядрени рецептори) и проницаемост на йони (йонни канали). Процентът се изразява като положителни или отрицателни стойности въз основа на увеличаване или намаляване на целевия протеин.

  • Изтеглете изображение с висока разделителна способност
  • Отваряне в нов раздел
  • Изтеглете Powerpoint

Данните показват процента на свързваща или протеинова активност (ензим, транспортер и йонни канали) при тестови концентрации от 10 μM (cis-PET, синя линия) и 1 μM (cis-PET, оранжева линия; Δ 9 -trans-THC, зелена линия). Представените данни се получават от два независими експеримента, всеки от които се извършва в два екземпляра. За пълни имена на съкращения вижте допълнителните материали. 100% е предназначен за пълна ензимна активност (ензими), транспорт на субстрат (мембранен транспортер), свързване с рецептори (GPCR и ядрени рецептори) и проницаемост на йони (йонни канали). Процентът се изразява като положителни или отрицателни стойности въз основа на увеличаване или намаляване на целевия протеин.

ДИСКУСИЯ

Освен това констатациите относно фармакологичните ефекти на cis-PET дават ярък пример за конвергентно развитие на биоактивни растителни вторични метаболити в растителното царство. Въпреки съществуването на повече от 20 000 вида бриофити в световен мащаб, cis-PET е първият психоактивен компонент в тази група растения. Наскоро бяха описани предполагаеми гени, участващи в биосинтеза на cis-PET (8). Потенциалът за злоупотреба с видове Radula вероятно е нисък, като се има предвид относително умерената сила и ниското изобилие на цис-PET (0,7 до 7% в екстракт) (5, 6) в сравнение с марихуаната, като съдържанието на Δ 9-транс-THC обикновено е по-висока от 10% (36). Независимо от това, cis-PET може да бъде интересно ръководство за разработването на лекарства, тъй като може да има по-малко странични ефекти от Δ 9-транс-THC и намалява простагландините. Вероятната значимост на специфичните за сигнализирането CB1R пътища (37), по-специално свързани с намалената биосинтеза на простагландини, наблюдавана с бибензиловото PET скеле, ще трябва да бъде проучена в модели на предклинични заболявания.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Общ

Химикали

Анализи за свързване на радиолиганда върху канабиноидни рецептори

[35 S] GTPγS анализ на свързване

Анализи за инхибиране на ензими за FAAH, MAGL, ABHD6, ABHD12 и COX-2

Ин витро фармакологичен скрининг

Животни

Експериментите in vivo бяха проведени в съответствие с Швейцарските федерални насоки, които са съгласни с указанията на Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC). Мъжки мишки BALB/c (на възраст от 8 до 10 седмици) са предоставени от Janvier Labs (St Berthevin, Франция). Мишките бяха настанени на групи от по петима в клетка в специфична единица, свободна от патогени, при контролиран 12-часов светлинен/12-часов тъмен цикъл (околна температура, 21 ° ± 2 ° C; влажност, 40 до 50%) със свободен достъп стандартна чау и вода за гризачи. Мишките се аклиматизират в дома за животни в продължение на 1 седмица преди експериментите.

Тест на Тетрад

Съединенията се разтварят в чист DMSO и се прилагат интраперитонеално в различни дози, като се използват пет до осем мишки за всяка третираща група. cis-PET, trans-PET и Δ 9-trans-THC са прилагани 1 час преди оценка на локомоцията, каталепсията, телесната температура и аналгезията (общо наричани тетраден тест). Ректалната температура беше измерена преди (базална) и 1 час след инжектиране с термодвойка (1 до 2 cm; Testo AG, Швейцария), а промяната в ректалната температура беше изразена като разлика между базалната и постинжекционната температура. Каталепсията беше измерена с помощта на баровия тест, където мишките бяха задържани в наложено положение с предни крайници, отпуснати на щанга с височина 4 cm; се разглежда крайната точка на каталепсия, когато и двата предни крайника са били отстранени или са останали над 120 s. Локомоцията се определя с помощта на ротарод тест; животните бяха поставени върху ротарода (Ugo Basile, Италия) при 6 оборота в минута и латентността за падане беше измерена с прекъсване от 120 s. Каталепсията и движението са измерени в три проучвания. Тестът с гореща плоча се извършва за оценка на аналгезия, като се използва котлон от 54 ° до 56 ° C (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) с цилиндър от плексиглас. Измерва се латентността към първия ноцицептивен отговор (облизване на лапата или разклащане на крака).

приготвяне на пробата

статистически анализи

Данните бяха събрани от най-малко три независими експеримента, всеки от които се извършва в три екземпляра. Резултатите се изразяват като средни стойности и стандартно отклонение на грешката. Статистическата разлика в значимостта между групите се определя от t-тест на Student (сдвоен, едно-опашен или двустранен t-тест) или еднопосочен ANOVA, последван от post hoc тест на Tukey. Статистическите разлики между лекуваната и контролната групи се считат за значими, ако p ≤ 0,05. Софтуерът GraphPad 5.0 е използван, за да отговаря на кривите, зависими от концентрацията, и за статистическия анализ.

ДОПЪЛНИТЕЛНИ МАТЕРИАЛИ

Фиг. S1. Анализ за изместване на радиолиганда с използване на [3H] CP55,940 и мембрани от CHO клетки, стабилно трансфектирани съответно с човешки CB1R и CB2R, съответно.

Фиг. S2. [35 S] GTPγS криви на свързване за THC и PET стереоизомери върху човешки канабиноидни рецептори.

Фиг. S3. LC-MS/MS количествени оценки на NAEs OEA, PEA и LEA в мозъка на BALB/c мъжки мишки 1 час след интраперитонеално инжектиране на канабиноиди.

Фиг. S4. LC-MS/MS количествено определяне на Δ9-транс-THC, cis-PET и транс-PET в плазма на BALB/c мъжки мишки 1 час след интраперитонеално инжектиране на канабиноиди.

Фиг. S5. Инхибиране на COX-2 активността.

Фиг. S6. Представителна хроматограма за мониторинг на реакция LC-MS/MS на референтни стандарти в мозъчна тъкан на мишка, показваща LC разделяне на цис- и транс-PET.

Таблица S1. Профилиране на THC и PET диастереоизомери върху ендоканабиноидни разграждащи ензими in vitro.

Синтез и характеризиране на продукти

Приготвяне на алилов алкохол 1

Това е статия с отворен достъп, разпространявана при условията на лиценза Creative Commons Attribution-NonCommercial, който позволява използване, разпространение и възпроизвеждане на всякакъв носител, стига резултантната употреба да е не за търговско предимство и при условие, че оригиналната творба е правилно цитирана.