Експресия на теломераза в клетъчни линии на Hodgkin lynphoma (HL). (А) PCR-базиран тест за повторно усилване на теломерите (TRAP), за да се определи наличието на активност на теломеразата (TA) в HL клетъчни линии. Буферът за лизис (LB) служи като вътрешен контрол за усилването, с изключение на фалшивите отрицателни резултати. Всички HL клетъчни линии изразяват TA. (B) Хистограма, показваща гънкавата промяна на относителната активност на теломеразата (RTA) в HL клетъчни линии в сравнение с CT висока (положителен контрол, равен на 100%). (C) Количествено определяне на интензивността на флуоресценция на hTERT протеин чрез имунофлуоресценция; Бяха отбелязани 10 000 клетки. Всички данни са представителни за три независими експеримента и се изразяват като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност. Експериментите са проведени в три екземпляра.

преходът

Характеризиране на алтернативния фенотип за удължаване на теломери (ALT) в HL клетъчни линии. (A) Количествено определяне на PML телата в HL клетъчни линии чрез имунофлуоресценция. Десет хиляди клетки бяха анализирани за всяка клетъчна линия. (B) Western blots на PML протеин в HL клетъчни линии. Глицералдехид-3-фосфатдехидрогеназата (GAPDH) беше използвана като контролна натоварване. (C) Честота на малки и големи клетки с колокализация на TRF2 и PML чрез PLA анализа. (D) Представителни клетки с колокализация на PML и TRF2 чрез анализ на PLA (жълта стрелка) и ръчна колокализация на PML (червена) и PNA-теломери (зелена) (жълта стрелка) (увеличение 40 ×). (E) Количествено определяне на T-SCE в хромозоми на HL клетъчни линии след оцветяване с CO-FISH. Хромозоми с (i) едно събитие на T-SCE, (ii) с две събития с T-SCE, оценени чрез едновременно използване на сонди с водеща и изоставаща верига, и (iii) с четири събития на T-SCE на двете вериги и на двете бяха оценени р и q рамена. (F) Изображение на метафази с T-SCE (бяла стрелка) в KMH2 клетки и делеции на теломери (зелена стрелка) (увеличение 63 пъти).

Теломераза и експресия на тялото на PML в HL клетъчни линии. (A) hTERT (зелен сигнал) и PML (червен сигнал) изразяват HDLM2 клетки на четири класа: (i) клетки без никакъв сигнал (синя рамка), (ii) hTERT положителни клетки (зелена рамка), (iii) клетки с hTERT и PML експресия (жълта рамка) и (iv) клетки с PML тела (червена рамка) (увеличение 10 пъти). (Б) Точкуване на честотата на всеки тип клетки съгласно тази класификация. За всяка клетъчна линия бяха отбелязани две хиляди клетки. (C) Интензивността на флуоресценцията е измерена в различните типове клетки чрез автоматизирано количествено определяне на hTERT и PML сигналите. Интензивността на флуоресценция на hTERT и PML се нормализира според площта на клетките и резултатите са представени според квартилите на площта на клетките. Представени са медианата, 95% доверителен интервал, min и max.

hTERT и PML експресия в пет HL клетъчни линии съгласно CD15/CD30 фенотип. (А) Четири субпопулации от всяка клетъчна линия бяха сортирани според CD30 и CD15 експресията: CD30−/CD15−, CD30 +/CD15−, CD30 +/CD15 +, CD30−/CD15 +; (B) hTERT и PML израз в CD30 +/CD15−; (С) в CD30 +/CD15 +; (D) в CD30−/CD15−; и (E) в CD30-/CD15 +. Клетки без оцветяване (синьо), клетки само с hTERT експресия (зелено), клетки с PML и hTERT експресия (жълто) и клетки с само PML експресия (червено). (F) Представителен образ на CD30 +/CD15 + L428 клетки и на CD30−/CD15− HDLM2 клетки, показващи различни видове PML и hTER експресия (увеличение 40 ×).

Имунофлуоресцентният анализ на CD30 (червен) и hTERT протеин (зелен) на клетки в лимфни възли на двама различни пациенти с HL демонстрира (A) наличието на много високи нива на hTERT в малки клетки без CD30 (розови стрелки), (увеличение 40 ×), (B) колокализация на hTERT и CD30 експресия в клетки на Ходжкин, (бели стрелки) и (C) отсъствие на hTERT експресия в HRS клетки (жълта рамка) (увеличение 40 ×).

In situ анализ на наличието на APB в участъци от HL лимфни възли. (А) Анализът на близостта на лигиране (PLA) е използван за анализ на взаимодействията PML/TRF2. Жълтата рамка показва малки клетки с множество и силни сигнали, а синята рамка големи клетки с малко сигнали (увеличение 40 ×). (B) IF-FISH оцветяване на PML (червено) и PNA теломери (зелено) показват колокализация на PML с теломерни последователности в малки клетки (жълта рамка) и висока експресия на PML в HRS клетка с малко сигнали за колокализация (оранжево рамка) (увеличение 40 ×).

Анализ на прехода между теломераза и ALT в HL лимфни възли от 38 пациенти. Лимфните възли на девет пациенти показват високи нива на теломераза, 24 се характеризират с наличието както на експресия на теломераза, така и с високо ниво на PML тела, а петима показват високо ниво на PML тела с ниска или неоткриваема hTERT експресия (увеличение 40 пъти).

Анализ на връзката между високата експресия на APB при пациенти с EBV + HL и клиничен резултат: (A) обща преживяемост, (B) свобода от прогресия и (C) преживяемост без събития.