Катедра по генетика, Медицински факултет на Университета Case Western Reserve, Кливланд, Охайо

нива

Център за изчислителна геномика и системна биология, Университет Case Western Reserve, Кливланд, Охайо

Катедри по човешка генетика, медицина, педиатрия и биология, Университет Макгил, Монреал, Квебек, Канада

Катедра по молекулярна и човешка генетика, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас

Катедри по човешка генетика, медицина, педиатрия и биология, Университет Макгил, Монреал, Квебек, Канада

Катедра по генетика, Медицински факултет на Университета Case Western Reserve, Кливланд, Охайо

Център за изчислителна геномика и системна биология, Университет Case Western Reserve, Кливланд, Охайо

Резюме

Повишените нива на хомоцистеин в кръвта са свързани с различни вродени дефекти и заболявания на възрастни. Не е ясно обаче до каква степен генетичните фактори контролират нивата на хомоцистеин при здрави индивиди. Лабораторните мишки са ценни модели за дисекция на генетичния и екологичен контрол на нивата на общия хомоцистеин (tHcy). Оценихме наследяването на нивата на tHcy при два инбредни щама, A/J и C57BL/6J (B6), при контролирани физиологични условия и оценихме относителната важност на генетичните, диетичните, половите и родителските ефекти. Диетата засяга средните нива на tHcy, докато полът засяга както средната стойност, така и вариацията на нивата на tHcy. Освен това полът на родителите е повлиял средните нива на tHcy в реципрочни F1 хибриди, което предполага майчини ефекти. И накрая, взаимодействията между гените и диетите повлияват наследствеността на средните нива на tHcy. Тези проучвания показаха, че всеки от тези фактори допринася за нивата на tHcy и предостави важни улики за разбирането на хомоцистеиновата хомеостаза при хората.

хиперхомоцистеинемията или повишените нива на общия хомоцистеин (tHcy) в кръвта е независим рисков фактор за дефекти на нервната тръба (NTD) (27a, 37), съдови заболявания (4, 43, 46) и болестта на Алцхаймер (36) и често се свързва със заболявания като рак на дебелото черво (20), остеопороза (25, 41) и синдром на Даун (3, 16). Въпреки че не е ясно дали повишените нива на tHcy са причина или последица от заболяването, поне един мета-анализ предполага, че хиперхомоцистеинемията причинява сърдечно-съдови заболявания (43).

Нормалните нива на tHcy в кръвта варират от 5 до 12 μmol/l (31), а хиперхомоцистеинемията се класифицира в три категории: лека (12–30 μmol/l), умерена (30–100 μmol/l) и тежка (> 100 μmol/л) (17, 31). Няколко екологични и генетични фактора влияят на нивата на tHcy в кръвта. Факторите на околната среда включват възраст (tHcy се увеличава с възрастта), пол (жените са склонни да имат по-ниски нива от мъжете) и диета (приемът на витамин кофактори като фолиева киселина и витамин B6 и B12 обикновено намалява нивата на tHcy) (26). Недостатъците в гените, участващи в метаболизма на хомоцистеин и фолат, водят до хиперхомоцистеинемия: тези гени включват цистатионин β-синтаза (CBS; Референции 2, 28), метионин синтаза (MTR; Реф. 45), метионин синтаза редуктаза (MTRR; Реф. 45) и метилентетрахидрофолат редуктаза (MTHFR; Реф. 9, 11, 19, 21).

Хомоцистеиновите и фолиевите пътища са тясно свързани и тяхното регулиране е сложно. Нивата на tHcy и фолиевата киселина обикновено са обратно свързани (34). Хомоцистеинът, съдържаща сяра аминокиселина, се реметилира по пътя на транс-метилирането или необратимо се катаболизира по пътя на транс-сулфурацията (29) и допринася за метилиране на ДНК, протеини и липиди и косвено към метаболизма на глюкозата и цикъла на лимонената киселина. Фолатният метаболизъм управлява основния пул от единични въглеродни единици и участва в биосинтеза на пурин и пиримидин и метаболизма на аминокиселините (34).

Мишки A/J и C57BL/6J бяха закупени от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME) и поддържани при специфични условия, свободни от патогени. Всички мишки споделят една и съща стая за животни с контролирана температура, влажност и 12: 12-часов цикъл светлина-тъмнина. На мишките се предоставя храна и вода ad libitum. Използването на мишки в тези проучвания е одобрено от институционалния комитет за грижа и употреба на животните в университета Case Western Reserve.

Диети

Изследване на инбреден щам.

Женските мишки бяха поддържани в 5010 LabDiet (Ричмънд, Индиана) в продължение на 3 седмици при пристигане от лабораторията Джаксън.

Наследяване на нивата на хомоцистеин в щамове A/J и B6.

Мишките се поддържат или на 5010 LabDiet (6,0 mg фолиева киселина/kg чау, лабораторна автоклавируема диета за гризачи 5010; Ричмънд, IN) или 7013 Harlan Teklad (1,83 mg фолиева киселина/kg чау; NIH-31 модифицирана диета за мишки/плъхове; Мадисън, Уисконсин). Потомството е отгледано от зачеването и на двете диети. В много случаи мишките, използвани в тези проучвания, са били на една и съща диета в продължение на няколко поколения.

Развъждане на мишки

Родителски щамове.

Отделни чифтосващи двойки мишки A/J и B6 бяха отгледани на всяка диета, за да се получи потомство, което беше тествано за пол, диета и щам.

F1 потомство.

Кръстовете между A/J женски и B6 мъжки произвеждат ABF1 мишки, а кръстоски между B6 женски и A/J мъжки произвеждат реципрочни BAF1 мишки.

F2 потомство.

Кръстовете между ABF1 мишки произвеждат ABF2 мишки, а кръстосванията между BAF1 мишки произвеждат реципрочно потомство BAF2.

Кръвни проби

Взети са кръвни проби от ретроорбиталния синус на мъжки и девствени женски мишки, които са били на възраст 6–8 седмици и са били събрани в нехепаринизирани епруветки. След центрофугиране серумни проби се съхраняват при -80 ° C. Девствените жени са използвани за контрол на възможните ефекти на бременността върху нивата на tHcy (18, 38).

Измервания на хомоцистеин

Нивата на tHcy бяха измерени чрез HPLC и тандемна масспектроскопия (TMS). И двата метода се състоят в редуциране на протеин-хомоцистеин дисулфидни връзки преди анализ.

HPLC методът на Ubbink et al. (39) беше използван.

Методът TMS на McCann et al. (24) беше използван.

TMS срещу HPLC: нормализиране на нивата на tHcy.

Предварителните данни показват последователно отклонение, при което пробите, измерени с HPLC, дават по-високи нива на tHcy от тези, измерени чрез TMS. За обединяване на данни от всяка техника е използван следният метод: използвани са нивата на tHcy от 490 проби, получени както с HPLC, така и с TMS и от 4 различни щама. От 490 проби, 282 са измерени с HPLC, а останалите с TMS. Средните нива на tHcy са изчислени за всяка група и корекционният коефициент се прилага, както следва

Анализ на данни

Статистически анализ.

За да се оценят разликите в средните нива на tHcy, Student’s т-тестът беше използван и нивата на значимост бяха подложени на подходящия корекционен фактор на Bonferroni, за да се отчетат множество тестове. За оценка на разликите в дисперсията е използван тестът на Levene (23). Когато равенството на дисперсията не беше постигнато, ние нормализирахме данните, но в повечето случаи неравенството на дисперсията се запази, повишавайки възможността самата дисперсия да е генетично контролирана черта. Поради това анализирахме две измервания на нивата на tHcy: средно и отклонение. За да тествате за разлики в средното, Student’s т-е използван тест. Тестът на Levene беше използван за тестване на различия във вариацията. И в двата случая нивата на значимост бяха подложени на подходящия корекционен фактор на Bonferroni, за да се отчетат множество тестове.

Оценки за наследственост.

Наследствеността е делът на генетичната дисперсия, който засяга характеристика и използва данни за двата родителски щама, F1 хибриди и F2 популация за своята оценка (8, 48)

Оценка на броя на независимите сегрегиращи гени.

Формулата на Райт (48) се използва за оценка на броя на гените, допринасящи за вариация на средните нива на tHcy

Това уравнение предполага, че 1) фенотипът следва нормално разпределение; 2) дисперсията на родителите и потомството от F1 е равна; и 3) всички участващи гени са несвързани, действайки по адитивен начин с еквивалентен принос към фенотипа (8, 48).

Проучване на инбредния щам

Малко се знае за нормалните нива на tHcy при мишки. Нивата на tHcy в серума са измерени в тринадесет различни инбредни щамове. Проучването показа, че нивата на tHcy варират от 3,2 до 7,0 μmol/l при жени, хранени с диетата LabDiet 5010 (фиг. 1). Открити са две основни групи инбредни щамове. Едната група включва EL/SuZ, NOD/LtJ, DDY/JeL, SWR/J и NOR/LtJ жени с обща tHcy средна стойност от 3,6 ± 0,1 μmol/l (диапазон 2,2-4,8 μmol/l), докато другата група включени жени CBA/CaJ, SWXL-4, BALB/cByJ, CBA/J, DBA/2J, C3H/HeJ и ABP/Le с обща средна стойност на tHcy от 6,2 ± 0,1 μmol/l (диапазон 4,6–8,4).

Фиг. 1.Общи нива на хомоцистеин при жени (tHcy) (μmol/l) сред 13 различни инбредни щама. Средните нива на tHcy (μmol/l) са както следва: EL/SuZ, 3,2 ± 0,4; NOD/LtJ, 3,3 ± 0,1; DDY/JeL, 3,5 ± 0,2; КСВ/J, 3,8 ± 0,1; NOR/LtJ, 4,2 ± 0,3; CBA/CaJ, 5,6 ± 0,1; SWXL-4, 5,6 ± 0,3; BALB/cByJ, 6,0 ± 0,2; CBA/J, 5,9 ± 0,1; DBA/2J, 6,3 ± 0,1; C3H/HeJ, 6,6 ± 0,4; ABP/Le, 7.0 ± 0.6. Стойностите се изразяват като средни стойности ± SE. За да се оценят разликите в средните нива на tHcy, беше използван еднопосочен ANOVA пост-тест за многократно сравнение Bonferroni. Инбредните щамове с подобно засенчване на диаграми имат сходство в нивата на tHcy; ns, без значение. Размер на пробата (н) и P са посочени стойности.

Наследяване на нивата на tHcy при мишки A/J и C57BL/6J

Нивата на tHcy в серума са измерени в A/J и B6 инбредни щамове, както и в техните реципрочни F1 хибриди и F2 потомство. Нивата на хомоцистеин са анализирани при мъже и жени при две различни диети, по-ниска фолатна киселина (Harlan Teklad 7013) и по-висока фолиева киселина (Lab Diet 5010). За опростяване, съдържанието на фолиева киселина се използва за разграничаване на двете диети, въпреки че те се различават по количествата на много други съставки (допълнителна таблица S1; достъпна на Физиологична геномика уеб сайт). 1

1 Допълнителният материал за тази статия (допълнителна таблица S1) е достъпен онлайн на http://physiolgenomics.physiology.org/cgi/content/full/00199.2004/DC1.

Анализирахме модели на вариация както на средното, така и на дисперсията на нивата на tHcy. Следващите проучвания трябва да изследват ефектите на специфични съставки във всяка диета.

Разлика в средните нива на tHcy

Ефекти на пола.

Нивата на tHcy се различават значително между жените и мъжете, както при щамовете A/J, така и при B6, които са били повишавани и при двете диети (Таблица 1). Въпреки това, противно на общата тенденция при хората (30), жените имат значително по-високи нива от мъжете и в двата щама (Таблица 1).

Таблица 1. Въздействие на пола и диетата върху средните нива на tHcy

Общите нива на хомоцистеин (tHcy) са изразени като средни стойности ± 1,96 SE (μmol/l); стойностите са посочени в скоби. Ефекти върху пола: нивата на tHcy са сравнени между жени (F) и мъже (M). Диетични ефекти: нивата на tHcy са сравнени между мишки, отгледани на диета с по-ниско съдържание на фолиева киселина (L) и тези, отгледани на диета с по-ниско съдържание на фолиева киселина (H). NS, не е значително.

Диетични ефекти.

Само при B6 женски и мъжки мишки нивата на tHcy се различават значително между двете диети. нивата на tHcy са били повишени при диетите с по-ниски и по-високи фолати и при двата пола (Таблица 1).

Ефекти на щама.

Нивата на tHcy са сравнени между A/J и B6 мишки, за да се изследват ефектите от генетичния фон. A/J женските и мъжките имат значително по-ниски нива на tHcy от мишките B6 от съответния пол. Тези разлики са установени независимо от диетата, на която са отгледани мишките (Фиг. 2 и 3)

Фиг. 2.нива на tHcy (μmol/l) при родителски щамове, мишки F1 и F2 при диета с ниско съдържание на фолиева киселина. Горна част бр. представляват размера на извадката (н), и отдолу бр. представляват означава ± 1,96 * SE. A: нива на tHcy при жените. Б.: нива на tHcy при мъжете. P са посочени стойности.


Фиг. 3.нива на tHcy (μmol/l) при родителски щамове, F1 мишки и F2 мишки на диета с по-високо съдържание на фолиева киселина. Горна част бр. представляват размера на извадката (н), и отдолу бр. представлява средно ± 1,96; * SE. A: нива на tHcy при жените. Б.: нива на tHcy при мъжете. P са посочени стойности.

Родителски ефекти.

За да се тестват ефектите от пола на родителите, нивата на tHcy са сравнени между реципрочни F1 хибридни мишки, т.е. ABF1 (където A се отнася до A/J майката) спрямо BAF1 (където B се отнася до майката B6). Полът на родителите не е повлиял нивата на tHcy при жените от F1, отгледани на нито една от диетите, т.е., A и Б.). Нивата на tHcy обаче се различават при реципрочните хибридни мъже, т.е. нивата на tHcy в ABF1

Таблица 2. Вариация в tHcy дисперсия за жени, отгледани на диета с по-ниско съдържание на фолиева киселина: щам, родителски и доминиращ ефект