Концептуализация на ролите, куриране на данни, официален анализ, придобиване на финансиране, разследване, методология, администриране на проекти, ресурси, софтуер, писане - оригинален проект

метаболомът

Отделение по анатомия, физиология и биохимия, Шведски университет по селскостопански науки, Упсала, Швеция

Концептуализация на роли, придобиване на финансиране, разследване, надзор, писане - преглед и редактиране

Отделение за клинични науки на Шведския университет за селскостопански науки, Упсала, Швеция

Роли Концептуализация, куриране на данни, набиране на средства, разследване, методология, софтуер, надзор, писане - преглед и редактиране

Отделение за хранене и управление на животните, Шведски университет по селскостопански науки, Упсала, Швеция

Роли Куриране на данни, разследване, писане - преглед и редактиране

Отделение за клинични науки на Шведския университет за селскостопански науки, Упсала, Швеция

Концептуализация на роли, придобиване на финансиране, писане - преглед и редактиране

Отделение по анатомия, физиология и биохимия, Шведски университет по селскостопански науки, Упсала, Швеция

Роли Куриране на данни, методология, писане - преглед и редактиране

Отделение за молекулярни науки, Шведски университет по селскостопански науки, Упсала, Швеция

Роли Куриране на данни, Придобиване на финансиране, Методология, Ресурси, Софтуер, Писане - преглед и редактиране

Отделение за молекулярни науки, Шведски университет по селскостопански науки, Упсала, Швеция

Роли Концептуализация, куриране на данни, разследване, методология, администриране на проекти, надзор, писане - преглед и редактиране

Отделение по анатомия, физиология и биохимия, Шведски университет по селскостопански науки, Упсала, Швеция

Концептуализация на ролите, куриране на данни, официален анализ, придобиване на финансиране, разследване, методология, администриране на проекти, надзор, писане - преглед и редактиране

Отделение по анатомия, физиология и биохимия, Шведски университет по селскостопански науки, Упсала, Швеция

  • Йосефин Сьодер,
  • Рагнви Хагман,
  • Йохан Диксвед,
  • Сана Линдозе,
  • Kjell Malmlöf,
  • Питър Агбак,
  • Али Моацами,
  • Катя Хьоглунд,
  • Сара Вернерсон

Фигури

Резюме

Цитат: Söder J, Hagman R, Dicksved J, Lindåse S, Malmlöf K, Agback P, et al. (2017) Метаболомът на урината се различава между слабите и наднормените кучета лабрадор ретривър по време на предизвикателство за хранене. PLoS ONE 12 (6): e0180086. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180086

Редактор: Карлос Е. Амброзио, Факултет по животновъдни науки и хранително инженерство, Университет в Сао Пауло, БРАЗИЛИЯ

Получено: 8 септември 2016 г .; Прието: 11 юни 2017 г .; Публикувано: 29 юни 2017 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Проучването е финансово подкрепено от Платформата за здраве и благосъстояние на бъдещите животни, Шведски университет за селскостопански науки, Фондация Thure F. и Karin Forsberg, Швеция, Фондация Michael Forsgren, Швеция и Шведски изследователски съвет Formas 222-2014-1341. Доц. Проф. Сара Вернерсон, DVM Йосефин Сьодер и доц. Проф. Али Моацами получи финансирането. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Затлъстяването е все по-голям проблем сред популацията от домашни кучета [1, 2], имитирайки човешкото положение в световен мащаб. Кучетата с наднормено тегло страдат от състояния, свързани със затлъстяването, като ранно начало на хронични заболявания, понижено качество на живот и съкратена продължителност на живота [3, 4], силно мотивиращо изследванията в района. Доказано е, че кучетата с наднормено тегло показват метаболитни промени [5–7], много от които се срещат и при затлъстели хора [8]. Произходът на затлъстяването е сложен, като се препоръчва да допринесат фактори на околната среда и начина на живот с полигенетичен произход [9]. Наскоро бе открита генетична мутация, регулираща апетита, при кучета лабрадор ретривър [10, 11], но патогенезата на кучешкото затлъстяване далеч не е разбрана.

Изследванията на метаболизма на затлъстелите фенотипове с помощта на метаболомика показаха обещаващи резултати при модели на хора и гризачи [12, 13]. Редица проучвания показват, че метаболитите в урината могат да различават субектите с наднормено тегло [14, 15], разкривайки метаболити, свързани със затлъстяването и потенциално променени метаболитни пътища. При кучета пробите от урина могат да се събират неинвазивно у дома, както и в болнична среда [16, 17] и следователно урината е едновременно практична и информативна био течност за метаболитни изследвания. Профилите на метаболитите на кучешката урина са анализирани успешно, показвайки връзки с ограниченията на породата, възрастта и диетата [18–20]. Доколкото ни е известно, нито едно предишно проучване не е съобщавало за използване на метаболомика на урината за анализ на проби след хранене или промени, свързани с наднормено тегло при кучета.

Повечето от наличните в момента данни за метаболомиката представят състоянието на гладно, въпреки че метаболизмът е силно динамичен процес. Изследванията при хора са доказали, че използването на предизвикателства, като прием на храна или упражнения, може да увеличи вариациите между отделните индивиди и да разкрие промени в метаболитите, които не се откриват при гладуване [21, 22]. По този начин дискриминацията между слабите и наднормените кучета може да бъде по-осъществима чрез проучване на състоянието след хранене в допълнение към състоянието на гладно.

В това проучване ядрено-магнитен резонанс (ЯМР) спектроскопия се комбинира с мултивариатен анализ в предизвикателство за фураж за оценка на относителните концентрации на метаболит в урината при здрави кучета лабрадор ретривър. Целта на проучването беше първо да се изследва дали метаболомиката, базирана на ЯМР, може да се използва за диференциране на постпрандиална от урина на гладно при кучета, и второ, да се изследва дали метаболитните профили се различават между постните и наднормените кучета в гладно и след урината след хранене.

материали и методи

Животни

Общ учебен дизайн

Хранителната история е придобита и честотата, с която на кучетата се дават остатъци от масата и се възнаграждават с обучителни лакомства и дъвчене на кучета, се оценява за всяко куче (таблица 1). Не бяха направени корекции на редовните домашни диети на кучетата със суха или мокра пълноценна храна за кучета и лакомства преди участие в проучването. Кучетата са гладували от 18 часа в деня преди клиничните проби. Сутринта в деня на прегледа водата беше задържана и от всяко куче беше взета проба от урина от всяко куче, преди да напусне дома. При пристигането в клиниката (между 8 и 9:30 ч.) Кучетата бяха прегледани от същия ветеринарен лекар (JS) и бяха взети кръвни проби на гладно за оценка на здравето, последвано от прием на тестово хранене. След 3 часа се вземат проби след урина. Изследването е одобрено от Етичния комитет за опити с животни, Упсала, Швеция (C180/12), и е получено писменото съгласие на собственика за всички кучета. Изследването е следвало насоките за докладване на наблюдателни проучвания в епидемиологията [23].

Оценка на здравословното състояние и телесното състояние

Въз основа на BCS, 12 кучета бяха класифицирани и групирани като слаби (BCS 4-5), а 16 като с наднормено тегло (BCS 6-8) [24]. Както беше описано по-рано [7], серумната концентрация на лептин на гладно се използва за проверка на оценката на клиничното състояние на тялото [25, 26]. Средната ± стандартна девиация (SD) концентрация на лептин (ng/ml) е значително по-висока (P = 0,048) в групата с наднормено тегло (5,7 ± 3,5), отколкото в слабата група (3,4 ± 1,9). Беше потвърдено, че телесното тегло е значително различно между двете групи кучета (P = 0,004), докато възрастта и идеалното телесно тегло не се различават значително.

Вземане на проби от урина и тест за предизвикване на фураж

Урината се събира от собствениците на кучета, като се използва устройство за вземане на проби с безплатен улов (Uripet, Rocket Medical, Вашингтон, Великобритания). Преди деня на прегледа кучетата са изпитали процедурата за вземане на проби от урина поне три пъти, за да ги приучат към процедурата. В деня на изследването утринната по естествен път урина се събира у дома и се съхранява охладена върху лед по време на транспортиране. В клиниката пробите от урина се центрофугират при 2000xg за 5 минути при + 4 ° C. След това пробите от урина бяха филтрирани (Filtropur S 0.2 um, Sarstedt AG & Co, Нюмбрехт, Германия), прехвърлени в полипропиленови тръби (SC Micro Tube PCR-PT, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Германия) и незабавно замразени при -70 ° ° С. Три часа след тестовото хранене в клиниката се събира постпрандиална урина и директно се третира и замразява по същия начин, както по-горе.

ЯМР спектрално придобиване и идентифициране на метаболити в урината

Преди NMR спектрално получаване, замразените проби от урина се размразяват при 6 ° C и от всяка проба се изтеглят 150 μl урина и се смесват със 150 μl фосфатен буфер (150 mM, pH 7,4, 0,01% TSP (3- (триметилсилил) - 2,2 ', 3,3'-тетрадеутеропропионова киселина)) в 3 mm NMR епруветка. ЯМР анализите са извършени на Bruker Avance II 600MHz спектрометър, оборудван с QCI H-C/P/N-D криопроба и SampleJet чейнджър за проби със система за охлаждане на проби (Bruker Biospin AG, Fällanden, Швейцария).

За спектрално придобиване и обработка е използван софтуерът TopSpin 3.1, доставен от Bruker Biospin AG. За придобиване беше използвана едномерна шумна последователност с предварителна наситеност на водата, със забавяне на релаксация от 4 секунди и 128 сканирания за всеки експеримент. Всички измервания са направени при 25 ° C. След придобиване, всеки спектър се трансформира по Фурие след умножаване чрез удължаване на линията от 0,5 Hz, коригира се фаза, коригира базова линия и се препраща към TSP при 0,0 ppm.

След това спектрите бяха анализирани с помощта на базата данни ChenomX NMR suite 7.5 (Chenomx Inc., Едмънтън, Канада). Общо 47 метаболита бяха идентифицирани във всеки спектър, използвайки базата данни ChenomX и техните концентрации бяха количествено определени в mM спрямо добавения вътрешен стандарт (TSP), след отчитане на припокриващи се сигнали. Тъй като креатининът и уреята присъстват в много по-високи концентрации от другите метаболити (креатинин до 1000 пъти по-висок и урея до 5000 пъти по-висок), всяка малка промяна в техните концентрации би рискувала да причини голяма промяна в относителното съотношение на други метаболити. Следователно тези два метаболита бяха изключени от наборите от данни, след което останаха 45 метаболита. За да се отчетат различните концентрации в пробите от урина, данните от времевите точки както на гладно, така и след хранене са трансформирани в относителни концентрации (% от общия mM), като се използва следната формула: [(mM метаболит)/(сума от mM от всички 45 метаболити)] x100. Следователно всички концентрации на метаболитите са относителни и са наричани по-долу „относителни концентрации“.

статистически анализи

Сдвоени и несдвоени t-тестове, тестът на Wilcoxon с подписан ранг и тестът на Mann-Whitney U са използвани за сравняване на нормално и ненормално разпределени данни (възраст, телесно тегло, идеално чисто телесно тегло, концентрации на лептин на гладно, концентрации на креатинин в урината, диетична анамнеза и специфично тегло на урината) между групите или времевите точки (GraphPad Prism 5.0, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Стойност на P Фиг. 1. Анализ на основните компоненти между времевите точки на гладно и след хранене.

Пробите от урина на гладно и след хранене показват ясно разделяне при анализа на основните компоненти (A). Всички 45 метаболити и всички 28 кучета са включени в този неограничен модел. Основният компонент (PC) 1 обяснява 12% от дисперсията и PC2 7%. Разделянето се оказа значимо в модела на дискриминантния анализ с частичен най-малък квадрат (PLS-DA) (за P-стойности, вижте раздела Резултати), където вземането на проби от урина на гладно и след хранене беше предварително дефинирано като две отделни групи. Графикът на натоварване (B) съответства на анализа на главния компонент (A). Дискриминационните метаболити, допринасящи значително за разделянето между урината на гладно и след хранене в модела PLS-DA (алантоин, таурин, цитрат и малонат) са подчертани в получер текст и с черни точки.

Слаби и с наднормено тегло кучета показват ясно разделяне в анализа на основните компоненти на набора от данни за урина след хранене (A). Всички 45 метаболита са включени в този неограничен модел. Основният компонент (PC) 1 обяснява 8% от дисперсията и PC2 4%. Разделянето се оказа значимо в модела на дискриминантния анализ с частичен най-малък квадрат (PLS-DA) (за P-стойности, вижте раздел Резултати), където слабите (n = 12) и кучетата с наднормено тегло (n = 16) бяха предварително дефинирани като две отделни групи. Графикът на натоварване (B) съответства на анализа на главния компонент (A). Дискриминантните метаболити, които допринасят значително за разделянето между слабите и наднормените кучета в модела PLS-DA (таурин, алантоин и гуанидоацетат), са подчертани в получер текст и с черни точки.

Дискриминационните метаболити, идентифицирани чрез мултивариантния подход, бяха допълнително изследвани чрез едномерен анализ на данните (GraphPad Prism 5.0, Сан Диего, Калифорния). Този анализ се извършва, за да се даде възможност за физиологична интерпретация на резултатите, т.е.да се определи дали концентрациите в урината на дискриминантните метаболити са били повишени или намалени между точките от времето или дали са били по-високи или по-ниски при слаби или наднормено тегло, съответно. Тестът с ранг на Wilcoxon и U-тест на Mann-Whitney са били използвани за ненормално разпределени сдвоени и несдвоени сравнения на относителните концентрации на метаболити между точките на гладно и след хранене (включително всички 28 кучета) и между слабите и наднормените кучета в периода след хранене . За отбелязване е, че само еднозначните метаболити, идентифицирани в PLS-DA моделите, са включени в едномерните статистически анализи и са извършени корекции на Bonferroni (P = 0,05/брой дискриминационни метаболити или сравнения), за да се противодействат на проблемите с множество сравнения.

Резултати

Здравен статус

За 28-те по същество здрави лабрадор ретривъри, включени в проучването, не са открити клинично забележими отклонения от хематологията или серумната биохимия. Стандартната химия на урината на урината е била в референтния диапазон за здрави кучета, както и специфичното тегло на урината (средно ± SD), което е 1,034 ± 0,01 в пробите на гладно и 1,032 ± 0,01 в пробите след хранене. Специфичното тегло на урината не се различава значително между часовите точки или между слабите (1,036 ± 0,01) и кучетата с наднормено тегло (1,033 ± 0,01) в урината на гладно. Средните ± SD концентрации на креатинин (mM), измерени чрез ELISA, не се различават съществено на гладно (17,2 ± 7,0) в сравнение с постпрандиалната урина (18,4 ± 7,8). Жизнените параметри при физически преглед бяха в референтния диапазон за здрави кучета, но при 11 кучета бяха открити незначителни здравословни проблеми, напр. леко скована походка и лека куцота, признаци на пародонтит, осезаемо периартикуларно образуване на остеофити и кожна фурункулоза. Нито едно от кучетата, показващи тези незначителни здравословни проблеми, не е изключено, тъй като жизнените параметри са нормални. Няма липсващи стойности в нито една от данните, събрани за 28 включени кучета. Не са открити значителни разлики в диетичната история между слаби и наднормено тегло кучета (Таблица 1).

Сравнение на времевите точки на гладно и след хранене

Имаше ясно разделение между точките на гладно и след хранене в относителните концентрации на метаболит в многовариантния PCA модел на всички 28 кучета (Фигура 1А). Значително разделяне беше потвърдено и в модела PLS-DA, използвайки двете времеви точки като предварително дефинирани групи (PLS-DA 1 comp: R 2 Y = 0.4, Q 2 Y = 0.32; CV-ANOVA: P = 0.00006). Използвайки VIP анализи, дискриминантните метаболити между точките на гладно и след хранене са идентифицирани като алантоин, таурин, цитрат и малонат (Таблица 2). Сравняването на графика на PCA (фигура 1А) със съответния график за натоварване (фигура 1В) разкрива, че концентрациите на таурин и цитрат са се увеличили, а концентрациите на алантоин и малонат са намалели в постпрандиал в сравнение с урината на гладно. Едновариантните анализи са в съответствие с многовариантните модели с изключение на малонат, който не е бил значим след корекция на Bonferroni (P Таблица 2. Дискриминантни метаболити между точките на гладно и след хранене при 28-те кучета лабрадор ретривър.

Сравнение на слаби и с наднормено тегло кучета

Резултатът за телесно състояние (BCS) беше оценен от същия ветеринарен лекар (JS) и 12 слаби (BCS 4-5) и 16 кучета с наднормено тегло (BCS 6-8) лабрадор ретривър бяха подложени на предизвикателство за хранене. Относителните концентрации на таурин са изчислени чрез нормализиране на моларната концентрация на таурин до общата моларна концентрация на всички 45 метаболита във всяка проба от куче (стойности, представени като Средно ± SD (% от общия тМ)). Тестът Mann-Whitney U е използван за сравнение между слаби и групи с наднормено тегло, съответно в точката на гладно и след хранене. Ниво на значимост P Таблица 3. Дискриминантни метаболити между слаби и с наднормено тегло кучета лабрадор ретривър в урина след хранене.

Дискусия

В това проучване използвахме NMR-базирана метаболомика, за да анализираме профилите на метаболитите на урината при здрави мъжки кучета лабрадор ретривър по време на тест за предизвикване на фураж. Открихме ясно разграничение между пробите от урина на гладно и след хранене, демонстрирайки, че тази методология може да се използва за анализи на урина при изследване на метаболитни събития в отговор на приема на храна при кучета. Нещо повече, с помощта на многовариантно моделиране се наблюдават значителни разлики в метаболитните профили между слаби и наднормено тегло при кучета след хранене, но не и при урина на гладно. Тези резултати предполагат, че метаболитните промени, свързани с наднорменото тегло и затлъстяването при кучета, могат да бъдат по-забележими при постпрандиал, отколкото при гладуване, което е в съгласие с общите констатации от проучвания при хора [21, 22]. Например, Krug et al демонстрират, че дискретни метаботипи, които не се наблюдават в нормално състояние на гладно, могат да бъдат разкрити след различни метаболитни предизвикателства при здрави доброволци [22] и Pellis et al са успели да идентифицират метаболитни промени, свързани с наднорменото тегло в постпрандиалната плазма, които не са били открити в на гладно невъзмутени условия [21].

Ограничения на проучването

Заключения

Това проучване демонстрира, че метаболомиката, базирана на ЯМР, може да разграничи 3-часовата урина след хранене на гладно и по този начин може да се използва за оценка на метаболитни събития в отговор на приема на храна при кучета. След предизвикателство за хранене открихме разлики в профилите на метаболитите на урината между слаби и наднормено тегло кучета, съчетани както с метаболизма на липидите, така и с протеините. Повечето от тези разлики не се откриват при условия на гладно, което предполага, че метаболитите на урината след хранене могат да бъдат по-полезни от метаболитите на гладно за идентифициране на метаболитни промени, свързани с наднорменото тегло и затлъстяването при кучета. Понижената относителна концентрация на таурин в урината, открита при кучета с наднормено тегло, може да показва промени в метаболизма на липидите, така че тауринът при кучета с наднормено тегло заслужава допълнително проучване.