От Royal Brompton National Heart and Lung Institute, Лондон, Великобритания.

предизвиква

От Royal Brompton National Heart and Lung Institute, Лондон, Великобритания.

От Royal Brompton National Heart and Lung Institute, Лондон, Великобритания.

От Royal Brompton National Heart and Lung Institute, Лондон, Великобритания.

Резюме

Заден план Подпомагането на скелетната мускулатура в кръвообращението при пациенти в краен стадий на сърдечна недостатъчност изисква електрическо обучение на клапата на гръбначния стълб, за да се получи устойчивост на умора. Този процес на електрическа трансформация и развитието на постмобилизационна атрофия води до дълбока загуба на генерирана пикова мощност. Агонистът на β2-адренорецепторите кленбутерол е използван за изследване на неговия потенциал за селективно индуциране на хипертрофия на скелетните мускули, особено мускула на гръбначния стълб (LDM), независимо от неблагоприятните ефекти върху сърдечния мускул.

Методи

Животни и режим на лечение

Хистология

Наличието на интерстициална фиброза беше определено на 6-μm участъци от LDM и лява камера (от контролни и лекувани с кленбутерол плъхове), които бяха напоени с разтвор на van Gieson (1 част 1% водна киселина фуксин, 9 части наситена водна пикринова киселина и 10 части дестилирана вода) за 5 минути. Излишното петно ​​се изплаква преди бързо обезводняване чрез потапяне в спиртна серия, изчистване и трайно монтиране. Слайдовете бяха изследвани за всякакви области на фиброза под светлинния микроскоп (Zeiss) и представителните зони бяха заснети.

Клетъчна култура

Първичните култури от сърдечни клетки на новородени плъхове са установени с модификации, както е описано по-горе. 23 Накратко, след трипсинизация и предварително поставяне в продължение на 45 до 60 минути, за да се ограничи броят на замърсяващите некардиоцити, клетките се посяват с плътност 3,75 × 10 6 клетки на 75-сантиметрова култура (5 × 104 клетки/cm 2) и позволено да се прикрепя за 24 до 36 часа в DMEM, допълнен с пеницилин/стрептомицин и 5% FCS. Немускулният клетъчен растеж се инхибира чрез добавяне на 0,1 mmol/L бромодезоксиуридин и клетките се поддържат в 5% CO2 атмосфера. Сутринта на ден 3, клетките бяха превключени на безсерумен DMEM/Medium 199 (4: 1), допълнен с пеницилин/стрептомицин/инсулин/трансферин (Sigma). Адренергичните агонисти или техният разредител (100 μmol/L аскорбинова киселина) се добавят към съдовете 6 часа след прехвърляне в среда без серум. След това средата се променя на всеки 24 часа с добавяне на пресен агонист или носител. За тези проучвания са използвани 4 μmol/L концентрации на норепинефрин, изопротеренол или кленбутерол.

РНК анализи

Изолиране на РНК и северно петно

‘Горещ’ RT-PCR анализ на актина и MHC Iso-mRNAs

Допълнителна ДНК се синтезира от 1 μg обща РНК, извлечена от контролните леви вентрикули, лекувани с кленбутерол, хипотиреоидни и хипертиреоидни плъхове, като се използва комплект за синтезиране на cDNA от първа верига и като праймер, oligo (dT) 18 според производителя инструкции (Pharmacia). Инкубациите бяха при 37 ° С в продължение на 1 час, последвано от денатурация при 95 ° С в продължение на 10 минути преди усилване. PCR амплификации бяха постигнати със следните олигонуклеотиди: праймер, ACC AGG GTG TCA TGG и обратен праймер, GTG AGC AGG GTC GGG. Аликвотна част от всяка RT реакция се взема за PCR и се усилва с Taq полимераза в присъствието на 5 ′ крайно белязан праймер, dNTPs и стандартен буферен микс (Promega). А-актиновите изоформи се отличават чрез усвояване на аликвотна част от PCR реакционната смес с 15 U Sac I (10 U/μL, Boehringer) за получаване на фрагменти от 202 bp за скелетен α-актин и 161 + 39 bp за сърдечен α-актин. Фрагментите се разделят върху 6% урея/полиакриламиден гел след добавяне на подходящ буфер за зареждане. Количественото определяне беше постигнато чрез денситометричен анализ на получените авторадиограми.

Статистика

Мокро тегло на скелетните мускули и сърцето. Хипертрофия се наблюдава в GPS (P LDM (20% до 29%)> сърце (18% до 20%) и е по-голям във всеки случай след 5 седмици в сравнение с 2 седмици лечение с кленбутерол. Имаше добра корелация между съотношението на сърцето до пищяла и съотношението LDM към пищяла (r= .81).

Хистология. За да се определи дали индуцираната от кленбутерол хипертрофия е свързана с някаква интерстициална фиброза на LDM или лява камера, се анализират секции от контролни и лекувани с кленбутерол плъхове след оцветяване на ван Гиесън. Оцветените от ван Гиесън участъци на лявата камера и LDM от контролни и лекувани с кленбутерол плъхове бяха сходни по външен вид (вж. Фиг. 2А и 2В). Мускулните влакна с жълто оцветяване са имали нормална морфология без данни за некроза. Розово оцветяващият колаген се наблюдава главно в адвентицията на кръвоносните съдове и в перимиума на LDM. Не са наблюдавани области на тежка интерстициална фиброза нито в скелетния, нито в сърдечния мускул.

РНК анализи в сърцето. Нивото на експресия на ANF в възрастната лява камера на плъха обикновено е само 2% до 3% от предсърдното ниво 29; въпреки това, засилената камерна експресия на ANF иРНК е един от най-добрите молекулярни маркери за всички форми на сърдечна хипертрофия. 30 За да се определи дали лекуваните с кленбутерол плъхове показват молекулярни промени в миокарда си в допълнение към увеличаването на вентрикуларната маса, нивата на ANF иРНК са измерени и нормализирани до 18S РНК (Фигура 3). Анализите показват, че нивата на ANF иРНК са три пъти по-високи във вентрикулите на третирани с кленбутерол животни (0,97 ± 0,24 AU) в сравнение с контролите (0,38 ± 0,17 AU) (P 21 31 За да опростим анализа, разработихме чувствителна и бърза техника, способна да прави разлика между тях. При създаването на този протокол трябваше да бъдат изпълнени няколко критерия. Те включват (1) идентификация на два олигонуклеотида, които хибридизират еднакво с двата MHC, които биха дали фрагменти с еднакви дължини и почти идентични последователности и (2) идентификация на вътрешен рестрикционен сайт в една от MHC последователностите, които могат да бъдат използвани за разграничаване между две изоформи. Бяха идентифицирани една такава последователност и едно ограничително място.

Експерименти ин витро

Следващият разгледан въпрос беше дали сърдечната хипертрофия може да се дължи на преки действия на кленбутерол. За да тестваме тази възможност, използвахме система от новородени кардиоцити в култура и измерихме експресията на ANF.

Снимка на кардиоцитите в културата е показана на Фигура 6. Добавянето на неселективен адренергичен агонист, норепинефрин или β-селективен адренергичен агонист, изопротеренол, бързо променя морфологията на кардиоцитите (Фиг. 6В и 6С), подобно на описаното по-рано. 4 33 34 Тези промени се характеризират с дълги цитоплазмени проекции между съседни миоцити и бързо биене. Хипертрофирали са само лекуваните с норепинефрин клетки. Тези промени обаче не са очевидни при клетки, третирани само с аскорбат. Всъщност тези клетки изглеждаха в покой. Добавянето на β2-селективен агонист кленбутерол в продължение на 3 дни към култивираните клетки не води до забележителни ефекти върху морфологията и изглежда, че клетките не бият по различен начин от тези, третирани само с аскорбат. Анализите на общата РНК, изолирана от новородените кардиоцити, показват, че експресията на ANF, нормализирана до 18S РНК, се увеличава само след приложение на норепинефрин- (0,52 ± 0,21 AU) спрямо третирани с аскорбат клетки (0,24 ± 0,07 AU). Не се наблюдава значителна промяна в експресията на ANF при изопротеренол (0,29 ± 0,19 AU) или при кленбутерол (0,29 ± 0,27 AU).

Дискусия

Това проучване показва, че кленбутеролът индуцира специфичен модел на хипертрофия при набраздени мускули на плъхове със значителна хипертрофия на LDM от порядъка на 20% до 30%. Този анаболен ефект е свързан с намаляване на съдържанието на мазнини в тялото, в съответствие с неговите свойства за разделяне, описани в предишни проучвания. 11 12 13

Анаболните стероиди са били използвани експериментално в опит да компенсират загубата на мускулна маса, въпреки че като цяло, всяка хипертрофия, предизвикана от тези агенти, изглежда не води до увеличаване на мощността. 35 36 Това може да се дължи на минералокортикоидния ефект, причиняващ хипертрофия, просто чрез повишено задържане на вода и сол, без да има значително повишено регулиране на съкратителните елементи. Допълнително ограничение при анаболните стероиди е тяхната полова специфичност и важни странични ефекти. Друг потенциален агент е кленбутерол, който е синтетичен аналог на епинефрин, а не стероид, поради което липсва специфичност на пола и е известно, че индуцира хипертрофия на скелетната мускулатура селективно при различни животински видове, с минимални последици. 11 12 Отговорът е истинска хипертрофия без хиперплазия и води до преход към бързо потрепване (и по този начин по-голямо пиково напрежение) на влакната. 37 Освен това е доказано, че кленбутеролът инхибира и обръща денервацията, 38 39 дизеуза, 40 ендотоксемия-, 41 и свързаната с кахексия 42 атрофия на скелетните мускули.

Нашето проучване показа значителна хипертрофия на непокътнатия нетрансформиран LDM при плъхове и е важна констатация с оглед на известната широка вариабилност в реакцията на кленбутерол, която показват различните скелетни мускули в един и същ организъм. Причината за тази променливост е неизвестна, но тя може да бъде свързана с разликите в плътността на β2-рецепторите в различни влакна на скелетните мускули. 43 Въпреки че като цяло се смята, че стимулиращите растежа ефекти на кленбутерол са медиирани от β2-адренорецептори, проучвания с антагонисти с пропранолол 44 45 46 са дали противоречиви резултати и могат да участват други все още неидентифицирани механизми (напр., Включващи предполагаемия β3-рецептор).

Ние вярваме, че констатациите в това проучване могат да имат важни клинични последици. По-специално, потенциалният ефект на кленбутерол върху електрически трансформирания LDM, за да доведе до устойчив на умора мускул, който е по-голям и по-мощен, може да има голяма стойност и трябва да бъде проучен. Може да се твърди обаче, че всяко потенциално използване на кленбутерол за индуциране на хипертрофия на LDM при пациенти със сърдечна недостатъчност в краен стадий, подложени на кардиомиопластика, ще бъде ограничено, ако се появи и съпътстваща сърдечна хипертрофия. Въпреки че наблюдението на индуцирана от кленбутерол хипертрофия в нормалното сърце на плъх е трудно да се екстраполира към отслабващото човешко сърце, молекулярните промени във физиологичната хипертрофия биха предположили, че подобен отговор може да не е непременно вреден и може да е от полза. Необходими са допълнителни проучвания, за да се изследват функционалните характеристики на разширеното кленбутерол сърце, както и да се разгледат острите и хронични ефекти на лекарството при модели на сърдечна недостатъчност при големи животни.

Има някои доказателства, че скелетните мускули, подложени на атрофия, са по-чувствителни към кленбутерол 39 и следователно реагират на достатъчно ниски дози, за да не предизвикат генерализирана хипертрофия на нормално инервирани мускули или всъщност сърдечна хипертрофия. Освен това, Palmer et al 50 показаха при плъхове, че лечението с фенбуфен (нестероидно противовъзпалително средство, което специфично инхибира синтеза на простагландин F2α) напълно инхибира индуцираната от кленбутерол сърдечна хипертрофия, без да затъмнява реакцията на скелетните мускули. Необходимо е да се предприеме проучване на концентрация-отговор, за да се определи дозата, необходима за предизвикване на хипертрофия на скелетните мускули, без да има едновременна сърдечна хипертрофия.

В заключение е установено, че кленбутерол предизвиква 20% до 30% хипертрофия на LDM при плъхове. Това е свързано с 18% до 20% хипертрофия на сърцето, което е показано на молекулярно ниво като физиологична хипертрофия, т.е. повече от трикратно увеличение на експресията на ANF mRNA, възникващо в камерата, без никакъв преход в контрактилния протеинов изо -mRNAs. Действието на кленбутерол върху електрически трансформирани скелетни мускули остава неизвестно и трябва да бъде проучено, за да се определи потенциалната му роля, ако има такава, в подпомагането на скелетните мускули.