Кенинг Уанг, 1 Йо Хошино, 1 Кеничи Даудел, 1 Марта Бош-Марс, 2 Тимоти Г. Майерс, 3 Майра Сармиенто, 1 Лесли Песникак, 1 Филип Р. Краузе, 2 и Джефри И. Коен 1

1 Лаборатория по инфекциозни болести, Национален институт по алергия и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

глутамин

2 Център за оценка и изследване на биологични продукти, Администрация по храните и лекарствата, Силвър Спринг, Мериленд, САЩ.

3 Клон за изследователски технологии, Национален институт по алергии и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

Адресна кореспонденция на: Джефри И. Коен, сграда 50, стая 6134, 50 Саут Драйв, Национален институт по здравеопазване, Бетесда, Мериленд 20892-8007, САЩ. Телефон: 301.496.5265; Имейл: [email protected].

Бележка за авторството: K. Wang и Y. Hoshino допринесоха еднакво за тази работа.

1 Лаборатория по инфекциозни болести, Национален институт по алергия и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

2 Център за оценка и изследване на биологични продукти, Администрация по храните и лекарствата, Силвър Спринг, Мериленд, САЩ.

3 Клон за изследователски технологии, Национален институт по алергии и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

Адресна кореспонденция на: Jeffrey I. Cohen, Building 50, Room 6134, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Телефон: 301.496.5265; Имейл: [email protected].

Бележка за авторството: K. Wang и Y. Hoshino допринесоха еднакво за тази работа.

Намерете статии от Хошино, Ю. в: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Лаборатория по инфекциозни болести, Национален институт по алергия и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

2 Център за оценка и изследване на биологични продукти, Администрация по храните и лекарствата, Силвър Спринг, Мериленд, САЩ.

3 Клон за изследователски технологии, Национален институт по алергии и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

Адресна кореспонденция на: Джефри И. Коен, сграда 50, стая 6134, 50 Саут Драйв, Национален институт по здравеопазване, Бетесда, Мериленд 20892-8007, САЩ. Телефон: 301.496.5265; Имейл: [email protected].

Бележка за авторството: K. Wang и Y. Hoshino допринесоха еднакво за тази работа.

Намерете статии от Dowdell, K. в: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Лаборатория по инфекциозни болести, Национален институт по алергия и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

2 Център за оценка и изследване на биологични продукти, Администрация по храните и лекарствата, Силвър Спринг, Мериленд, САЩ.

3 Клон за изследователски технологии, Национален институт по алергии и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

Адресна кореспонденция на: Джефри И. Коен, сграда 50, стая 6134, 50 Саут Драйв, Национален институт по здравеопазване, Бетесда, Мериленд 20892-8007, САЩ. Телефон: 301.496.5265; Имейл: [email protected].

Бележка за авторството: K. Wang и Y. Hoshino допринесоха еднакво за тази работа.

Намерете статии от Бош-Марс, М. в: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Лаборатория по инфекциозни болести, Национален институт по алергия и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

2 Център за оценка и изследване на биологични продукти, Администрация по храните и лекарствата, Силвър Спринг, Мериленд, САЩ.

3 Клон за изследователски технологии, Национален институт по алергии и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

Адресна кореспонденция на: Джефри И. Коен, сграда 50, стая 6134, 50 Саут Драйв, Национален институт по здравеопазване, Бетесда, Мериленд 20892-8007, САЩ. Телефон: 301.496.5265; Имейл: [email protected].

Бележка за авторството: K. Wang и Y. Hoshino допринесоха еднакво за тази работа.

1 Лаборатория по инфекциозни болести, Национален институт по алергия и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

2 Център за оценка и изследване на биологични продукти, Администрация по храните и лекарствата, Силвър Спринг, Мериленд, САЩ.

3 Клон за изследователски технологии, Национален институт по алергии и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

Адресна кореспонденция на: Джефри И. Коен, сграда 50, стая 6134, 50 Саут Драйв, Национален институт по здравеопазване, Бетесда, Мериленд 20892-8007, САЩ. Телефон: 301.496.5265; Имейл: [email protected].

Бележка за авторството: K. Wang и Y. Hoshino допринесоха еднакво за тази работа.

Намерете статии от Сармиенто, М. в: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Лаборатория по инфекциозни болести, Национален институт по алергия и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

2 Център за оценка и изследване на биологични продукти, Администрация по храните и лекарствата, Силвър Спринг, Мериленд, САЩ.

3 Клон за изследователски технологии, Национален институт по алергии и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

Адресна кореспонденция на: Джефри И. Коен, сграда 50, стая 6134, 50 Саут Драйв, Национален институт по здравеопазване, Бетесда, Мериленд 20892-8007, САЩ. Телефон: 301.496.5265; Имейл: [email protected].

Бележка за авторството: K. Wang и Y. Hoshino допринесоха еднакво за тази работа.

Намерете статии от Pesnicak, L. в: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Лаборатория по инфекциозни болести, Национален институт по алергия и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

2 Център за оценка и изследване на биологични продукти, Администрация по храните и лекарствата, Силвър Спринг, Мериленд, САЩ.

3 Клон за изследователски технологии, Национален институт по алергии и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

Адресна кореспонденция на: Jeffrey I. Cohen, Building 50, Room 6134, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Телефон: 301.496.5265; Имейл: [email protected].

Бележка за авторството: K. Wang и Y. Hoshino допринесоха еднакво за тази работа.

1 Лаборатория по инфекциозни болести, Национален институт по алергия и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

2 Център за оценка и изследване на биологични продукти, Администрация по храните и лекарствата, Силвър Спринг, Мериленд, САЩ.

3 Клон за изследователски технологии, Национален институт по алергии и инфекциозни болести, NIH, Bethesda, Мериленд, САЩ.

Адресна кореспонденция на: Джефри И. Коен, сграда 50, стая 6134, 50 Саут Драйв, Национален институт по здравеопазване, Бетесда, Мериленд 20892-8007, САЩ. Телефон: 301.496.5265; Имейл: [email protected].

Бележка за авторството: K. Wang и Y. Hoshino допринесоха еднакво за тази работа.

Публикувано на 5 юни 2017 г. - Повече информация

Хроничните вирусни инфекции са трудни за лечение и са необходими нови подходи, особено тези, насочени към намаляване на реактивацията чрез засилване на имунните реакции. Вирусът на херпес симплекс (HSV) установява латентност и се активира често и може да се случи пробивно реактивиране въпреки потискащата антивирусна терапия. Т-клетките, специфични за вируса, са важни за контролиране на HSV, а пролиферацията на активирани Т-клетки изисква повишен метаболизъм на глутамин. Тук открихме, че добавянето с орален глутамин намалява реактивирането на вируса при латентно заразени с HSV-1 мишки и заразени с HSV-2 морски свинчета. Анализът на транскриптом на тригеминални ганглии от латентно заразени с HSV-1, третирани с глутамин WT мишки показва повишена регулация на няколко IFN-γ-индуцируеми гени. За разлика от WT мишките, допълнителният глутамин е неефективен при намаляване на скоростта на реактивиране на HSV-1 при латентно заразени с HSV-1 IFN-γ-KO мишки. Мишките, лекувани с глутамин, също имат по-голям брой HSV-специфични IFN-γ-продуциращи CD8 Т клетки в латентно инфектирани ганглии. По този начин, глутаминът може да подобри свързания с IFN-y имунен отговор и да намали скоростта на реактивиране на латентна вирусна инфекция.

Приблизително 60% от хората в САЩ са заразени с херпес симплекс вирус тип 1 (HSV-1) и 20% с HSV-2. Профилактичната терапия с ацикловир или валацикловир намалява честотата на рецидивите на херпес (херпес лабиалис) с 40% –60% и скоростта на реактивиране на гениталния херпес със 70% –80%. По този начин са необходими други подходи за намаляване на реактивирането на HSV. Контролът на реактивирането на HSV корелира със специфични за вируса Т клетки (1). Повишената функция на Т-клетките може да намали реактивирането на вируса. Хранителните вещества, включително глюкозата и някои аминокиселини, са от решаващо значение за активирането на Т-клетките (2). Активираните Т клетки изискват повишен метаболизъм на глюкоза и глутамин за пролиферация, а лишаването или инхибирането на синтеза на тези молекули намалява пролиферацията на Т клетки (3, 4).

Реактивиране на HSV-1 в тригеминални ганглии на мишки, получаващи глутамин, глицин или без добавка в питейната си вода. Животните се инокулират с HSV-1 чрез скарификация на роговицата, получават допълнителна аминокиселина 2 седмици по-късно и след това, след допълнителни 2 седмици, се анестезират и очите им се излагат на UV облъчване. Два дни по-късно животните бяха евтаназирани, тригеминалните ганглии бяха отстранени и хомогенизирани, хомогенатите бяха поставени върху монослоевете на Vero клетки и беше определен броят на ганглиите с реактивиран вирус. Бяха проведени три отделни експеримента (A-° С) и са показани резултатите на 5-ия ден в културата за всичките 3 експеримента (д). Експеримент 1 имаше по 25 мишки във всяка група, а експерименти 2 и 3 имаха по 15 мишки в групата на глутамин и глицин и 7 и 10 мишки в групата без добавки, съответно. Точният тест на Фишър е използван за статистика.

Честота на рецидиви на генитален HSV-2 при морски свинчета, получаващи глутамин или без добавка в питейната си вода. Животните бяха инокулирани интравагинално с HSV-2 и след възстановяване (2 седмици по-късно на 15-ия ден) те бяха разделени на 2 групи (въз основа на резултатите от лезии след остра инфекция) и глутаминът беше добавен към питейната вода на 1 от 2-те групи. Животните се наблюдават за рецидиви и се получават оценки на заболяванията всеки ден; средният брой на кумулативните рецидиви на морско свинче във всяка група е начертан във всеки от 2 отделни експеримента (A и Б.). В края на периодите на лечение всички животни бяха извадени от терапията (период на измиване) и наблюдавани за рецидиви във всеки от 2-те отделни експеримента (° С и д). Експеримент 1 (A и ° С) имаше 9 животни на група; експеримент 2 (Б. и д) имаше 15 на група. Дву опашка т за статистика е използван тест.

Латентното вирусно натоварване на HSV-1 в тригеминалните ганглии на мишки (14) и броят на инфилтриращите CD8 Т клетки в ганглиите корелират с вероятността за реактивиране ex vivo (14, 15). По-високите вирусни натоварвания и по-малкият брой CD8 Т клетки са свързани с повишени скорости на реактивация. Поради това тествахме дали лечението с глутамин на мишки намалява латентното вирусно натоварване в тригеминалните ганглии или броя на инфилтриращите CD8 Т клетки. Латентното ниво на ДНК на HSV-1 в тригеминални ганглии на мишки, лекувани с глутамин, не се различава значително от това на животни, третирани само с глицин или вода (Допълнителна фигура 2А; P ≥ 0,14 чрез тест на Kruskal-Wallis). Броят на CD8 Т клетките, инфилтриращи ганглиите при животни, лекувани с глутамин, не се различава значително от този при животни, третирани само с глицин или вода (Допълнителна фигура 2В; P = 0,58, тест на Kruskal-Wallis). По този начин, по-ниските скорости на реактивация, наблюдавани при мишки, лекувани с глутамин, не се дължат на по-ниско латентно натоварване на HSV-1 или увеличаване на общия брой CD8 Т клетки в тригеминалните ганглии.

Клетъчни гени, регулирани във всички 3 микрочипови анализа в тригеминални ганглии на мишки, лекувани с глутамин

Тъй като глутаминът увеличава експресията на IFN-γ-индуцирани гени на латентно заразени мишки, тествахме дали мишките, неспособни да експресират IFN-γ, няма да покажат намаляване на реактивирането на HSV-1 след лечение с глутамин. Ifng -/- мишки (IFN-γ нокаутиращи мишки) бяха заразени с HSV-1 и третирани с глутамин или без добавка, както е описано по-горе. Честотата на реактивиране е по-висока при IFN-γ нокаутиращи мишки в сравнение с WT мишки в отсъствието на допълнителен глутамин, вероятно поради ролята на IFN-y в контрола на вирусния товар и реактивирането. Лечението на IFN-γ нокаутиращи мишки с глутамин имаше малък ефект върху намаляването на скоростта на реактивиране в сравнение с това при животни, които не получават допълнителен глутамин в 2 независими експеримента (Фигура 3, A и B), в съответствие с наблюдението, че глутаминът регулира IFN-γ –Индуцируеми гени.

Реактивиране на HSV-1 от тригеминални ганглии на WT и IFN-γ нокаутиращи мишки и HSV-1-специфични IFN-γ-продуциращи CD8 T клетки в WT мишки, получаващи глутамин или без добавка. (A и Б.) Реактивиране на HSV-1 от тригеминални ганглии (TG) на WT и IFN-γ нокаутиращи мишки, получаващи глутамин или без добавка в питейната си вода. Първият експеримент имаше 10 WT мишки и 11 IFN-γ нокаутиращи мишки в глутаминовата група и 13 WT мишки и 12 IFN-γ нокаутиращи мишки във водната група (A); вторият експеримент е имал 17 WT мишки и 16 IFN-γ нокаутиращи мишки в глутаминовата група и 15 WT мишки и 16 IFN-γ нокаутиращи мишки във водната група (Б.). Вижте легендата към Фигура 1 за експериментални подробности. (° С и д) Брой на специфични за HSV-1 IFN-γ-продуциращи CD8 Т клетки на 10 6 лимфоцити (° С) и общо CD8 Т клетки на ганглий (д) на мишки, получаващи глутамин или без добавка в питейната си вода. Резултатите от 4 независими експеримента бяха обединени. Десет мишки бяха използвани в групата без инфекция и по 30 в групата без лечение и глутамин. Тестът на Ман-Уитни е използван за статистика; е показана средната стойност ± SEM.

За по-нататъшно изследване на ролята на глутамин и IFN-γ за предотвратяване на реактивация, разгледахме специфични за HSV IFN-γ-продуциращи CD8 Т клетки в ганглиите, тъй като се смята, че тези клетки са важни за предотвратяване на реактивирането в ганглиите (16) . Латентно заразените мишки, лекувани с глутамин, са имали значително по-голям брой HSV-специфични IFN-y-продуциращи CD8 Т клетки в тригеминални ганглии, отколкото нелекувани животни (P = 0,007, тест на Ман-Уитни) (Фигура 3С), докато общият брой на CD8 Т клетки в третирани и нетретирани групи не се различава значително (P = 0,375) (Фигура 3D). Тези резултати, заедно с наблюденията при IFN-γ нокаутиращите мишки и констатациите от РНК микрочипове, подкрепят хипотезата, че глутаминът действа чрез IFN-γ пътя за намаляване на реактивирането на HSV-1. Докато глутаминът също може да повлияе на репликацията на вируса и следователно реактивирането, ние смятаме, че това е по-малко вероятно, тъй като предишни проучвания не показват ефект на глутамин върху репликацията на WT HSV in vitro (12).

IFN-γ е важен за контролиране на реактивирането на HSV. Т-клетките в латентно заразени с HSV-1 ганглии на хора и мишки експресират IFN-γ (17). IFN-γ намалява реактивирането от латентност в няколко животински модела. IFN-y се произвежда от CD8 Т клетки в клетъчни суспензии от латентно инфектирани с HSV-1 миши тригеминални ганглии (18). Добавянето на IFN-y към латентно заразени тригеминални клетъчни култури намалява реактивирането на HSV-1 (18). IFN-γ нокаутиращите мишки имат по-високи нива на реактивиране на HSV (19). Установихме, че глутаминът повишава нивото на няколко IFN-γ-индуцируеми гени, включително Cxcl9, което е критично за контролиране на гениталния HSV-2 чрез мобилизиране на специфични за вируса цитотоксични Т-клетки към нервната система и вагината при мишки (20). Някои изследвания поставят под въпрос значението на Т-клетките за контролиране на реактивацията, тъй като само малка част от латентно заразените човешки неврони са заобиколени от Т-клетки; обаче се смята, че броят на активираните Т-клетки, съседни на заразени с HSV неврони, се увеличава, когато в тези неврони настъпи реактивиране на вируса на ниско ниво (21, 22).

Стресът може да доведе до изчерпване на глутамин и нарушена функция на лимфоцитите. Стресът също така увеличава скоростта на реактивиране на HSV (23). Стресът може да намали броя на CD8 Т клетките в латентно заразени ганглии и способността на специфичните за HSV-1 CD8 Т клетки в ганглиите да произвеждат IFN-γ в отговор на реактивирането на вируса (23). Следователно, глутаминът може да обърне ефектите на стреса върху отговорите на CD8 Т клетки и да намали реактивирането.

Докато глутаминът намалява скоростта на реактивиране на in vivo HSV-1 в тригеминални ганглии на мишки само с 50%, това е същото ниво на ефект, което антивирусната супресивна терапия има при намаляване на честотата на симптоматичните рецидиви на HSV-1 херпес лабиалис (24). Освен това, докато ацикловирът частично намалява гениталните рецидиви на HSV-2, той не намалява 2 до 3 пъти повишения риск от придобиване на ХИВ, свързан с HSV-2 (25). По този начин е очевидна необходимостта от други терапии за потискане на рецидиви на орален и генитален HSV. Способността на глутамин да намалява реактивирането на HSV при 2 различни животински модела предполага нов подход за намаляване на реактивирането на вируса при хората.

Статистика. Всички статистически данни с изключение на микрочипове са направени в JMP 7.0.2 (SAS Institute); P по-малко от 0,05 се счита за значимо. Нормализирането на данните от микрочипове и диференциалното изразяване бяха изчислени с помощта на SAS и JMP/Genomics 4.0 (SAS Institute).

Одобрение на проучването. Всички експерименти с животни са извършени по протоколи, одобрени от Комитетите за грижи и употреба на животните към Националния институт по алергии и инфекциозни болести и Администрацията по храните и лекарствата. Пълно описание на методите е дадено в Допълнителни методи.

YH, KW, KD, MS, LP, MBM и PRK извършиха проучванията върху животни. KW и YH направиха PCR в реално време. KD определя количествено специфични за вируса CD8 клетки в ганглии. TGM извършва експерименти и анализи с микрочипове. JIC, YH и KW са проектирали проучването. JIC, YH, KW, TGM и PRK написаха статията.

Това изследване беше подкрепено от интрамуралните изследователски програми на Националния институт по алергия и инфекциозни болести и Центъра за оценка и изследване на биологичните препарати. Тази статия е посветена на паметта на Присила Шафер, която е вдъхновила тази работа.

Конфликт на интереси: Авторите са декларирали, че не съществува конфликт на интереси.