Astha Nigam 1 *, Avnish Kumar 2, Madhusudan HV 1 и Neelam Bhola 1

1 Катедра по микробиология, CloneGen (P) Ltd. NOIDA, Индия.

2 Катедра по биотехнологии, Училище за науки за живота, д-р Б. Р. Амбедкар, Агра, Индия.

* Автор-кореспондент: Astha Nigam
Лаборатория Стенли Браун
Обществена болница TLM
Нанд Нагри, Шахдара, Делхи-110093
Електронна поща: [имейл защитен]

Резюме

Ключови думи

потенциални пробиотични атрибути; грам-отрицателни бактерии; инвитро; пречистване и пресяване.

Въведение

Балансът между микробните групи, присъстващи в човешките черва, е от решаващо значение за поддържането на здравето. Когато този баланс е нарушен, връзката гостоприемник-микроб може да прогресира към болестно състояние. Освен това е описано, че отклоненията в микробията са свързани с повишен риск от специфични заболявания, включително възпалителни заболявания на червата, раздразнителни заболявания на червата и диария, свързана с антибиотици и е свързана с алергия, затлъстяване и диабет [1]. По този начин поддържането на равновесие на микро биота е важно за запазването и укрепването на здравето. Консумацията на храна, съдържаща живи бактерии, е най-старият и все още най-широко използван начин за увеличаване на броя на полезните бактерии, наречени „пробиотици“ в чревния тракт [2]. Забележително е, че има голям брой пробиотични храни, които датират от древни времена, които са предимно от ферментирали храни, както и от култивирани млечни продукти [3-10]. Стремежът да се намерят хранителни съставки с ценни биоактивни свойства насърчи интереса към млечнокиселите бактерии (LAB) с пробиотични атрибути като антибактериална активност срещу патогенни микроорганизми [11], антивирусна активност [12], противогъбично свойство [13], анти- мутагенни [14], антитромбоцитна агрегация [15] и антиоксидантни свойства [16] и др.

Като цяло се смята, че пробиотиците спомагат за поддържане на баланса между вредните и полезните бактерии в червата, като по този начин поддържат здрава храносмилателна система [10]. Здравните претенции на пробиотиците варират от регулиране на активността и благосъстоянието на червата до по-специфични действия като антагонистичен ефект върху стомашно-чревните патогени като Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori и Rotavirus и др. [17]. Известно е, че някои неутрализират хранителните мутагени, произведени в дебелото черво, измествайки имунния отговор към Th2 отговор, облекчавайки алергичните реакции и понижавайки серумния холестерол [18].

Механизмът на действие на пробиотиците с антибактериални свойства може би се дължи на производството на бактериоцини като ницин [19] или понижаване на рН чрез получаване на кисели съединения като млечна киселина [20]. Пробиотичните щамове се конкурират с други инфекциозни бактерии за хранителни вещества и клетъчна повърхност и им помагат, като инхибират тяхната колонизация [21]. Известно е също, че няколко щама произвеждат активни ензими, които инхибират други патогенни бактерии [22]. Ползите за здравето от пробиотиците винаги са били изследвани по отношение на способността им да поддържат тяхната наличност, жизнеспособност [23], смилаемост и предоставяне на техните ползи за здравето на гостоприемника, без да променят безопасността [24] и органолептичните свойства на храната в които са включени [25]. Днес на пазара се предлагат жизнеспособни пробиотични щамове с полезни функционални свойства като компоненти на храни и напитки, във ферментирали млечни продукти като кисело мляко [26] или като обогатени с пробиотици храни, както и хранителни консерванти [27]

Материали и методи

Проби за изолиране на LAB

Пробите за изолиране на LAB от сурово мляко, извара, домати и доса тесто се оставят да ферментират при температура на околната среда (32 ° C ± 2).

Среда и реактиви

Изолирането, както и култивирането на LAB се извършва с помощта на среда De Man Rogosa Sharpe (MRS) за антибактериален анализ, като патогенните култури, а именно E. coli, S. aureus, P. aeruginosa и B. cereus, се отглеждат в инфузия на мозъчно сърце ( BHI) агарова среда. Хранителната среда за агар (NA) също се използва за антибактериалния анализ. Реагентите, индикаторът, въглеродните субстрати за биохимични тестове и др., Използвани в изследването, са с аналитично качество и са доставени от Hi Media Chemicals Ltd., Мумбай, Индия.

Изолиране на LAB

Изолирането на LAB от избраната проба се извършва, като се използва методът на микробната изливаща плоча. Подходящи разреждания на пробите, приготвени във физиологичен разтвор (0,85% NaCl) се изсипват в MRS среда за изолиране на LAB. След това плаките се инкубират при 37 ° С ± 2 ° С за период от 24-48 часа. Колониите, които се различават помежду си по своята морфология и фенотипичен вид, се събират и инокулират в агарови наклони. Колонии, които са били под повърхността, са били инокулирани като прободни.

Предполагаемите LAB видове бяха пречистени с помощта на съответните им изолиращи среди чрез повторно нанасяне на ивици върху плочи, докато присъства само един вид колония. Така получените различни чисти култури се характеризират със своята морфология на колониите и се подлагат на оцветяване по Грам. За по-нататъшни експерименти са избрани само Грам положителни, неподвижни, пръчковидни бактерии, показващи фенотипни характери, подобни на видовете Lactobacillus на MRS агаризираща среда (L. salivarius, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus, L. fermentum и L. acidophilus). Културите се съхраняват и поддържат при 4 ° C върху MRS агарни наклонени/прободни стъбла за по-нататъшни изследвания.

Определяне на антибактериалната активност на L. salivarius, L. bulgaricus, L. fermentum и L. acidophilus

Приготвяне на пробен филтрат

Избраните LAB видове (L. salivarius, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus, L. fermentum и L. acidophilus) бяха инокулирани от наклонени плодове в пресен 250 ml MRS бульон и инкубирани при 37 ° С в продължение на 48 часа. Културният бульон от всеки изолат се центрофугира отделно при 10 000 х g (Sorvall супер скорост RC2-B) в продължение на 30 минути. Супернатантата се събира след центрофугиране и се прекарва през 0,2 μm стерилен филтър за спринцовки (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ). За да се потвърди производството на бактериоцин, безклетъчните неутрални супернатантни бульони бяха събрани за антибактериалното изследване срещу избрани хранителни патогени.

Среда за растеж на патогени

Чистите култури на хранителни патогени, а именно Е. coli, S. aureus, P. aeruginosa и B. cereus, са инокулирани от наклони в мозъчен инфузионен бульон (BHIB). След 24 часа инкубация при 37 ° С, бульонът за култивиране се центрофугира и получената пелета се суспендира в 9 ml физиологичен разтвор. Тази суспензия се използва за инокулиране на патогенния щам върху плочи с хранителен агар за определяне на антибактериалната активност на филтрата на пробата.

Тест за антибактериална активност чрез метод за дифузия на кладенец в агар

Методът на дифузия на агарни кладенци се използва за определяне на антибактериалното свойство на LAB изолатите. 24-часова култура от патогени (Е. coli, S. aureus, P. aeruginosa и В. cereus), отглеждани в BHIB при 37 ° С, бяха суспендирани във физиологичен разтвор. Поляна от индикаторния щам беше направена чрез разпределяне на клетъчната суспензия върху повърхността на хранителни плочи от агар със стерилен памучен тампон. Плочите се оставят да изсъхнат и се използва стерилен корков отвор с диаметър (5 mm) за изрязване на еднородни ямки в агара. Всяка ямка се пълни с 60 ± 1 филтрат без култура, получен от LAB изолатите. След инкубация при 37 ° С в продължение на 48 часа, плаките се наблюдават за зона на инхибиране (ZOI) около кладенеца. Резултатите се считат за положителни, ако диаметърът (mm) на ZOI е по-голям от 1 mm. Експериментът се провежда в три екземпляра и активността се отчита като диаметър на ZOI ± SD.

Идентифициране на LAB изолати

Идентифицирането на мощни изолати до ниво на видовете е направено въз основа на характеристиките на Lactobacillus, както е описано в Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology [28] и описателна таблица, дадена от Nair и Surendran [29]. Културите бяха подложени на група биохимични тестове, които включваха ферментация на различни източници на въглерод, производство на киселина и газ от глюкоза, тест за каталаза, растеж при различни температури (15 ° C, 45 ° C и двете) и хидролиза на аргинин.

Резултати и дискусия

Изолиране на млечнокисели бактерии (LAB) от сурово мляко, извара, домати и доса

Млечнокиселите бактерии (LAB) бяха изолирани от сурово мляко, извара, домати и доса тесто върху MRS агар първоначално. Всички получени изолати са морфологично характеризирани от характеристиките на колонията на получените изолати, заедно с тяхната Грам реакция и микроскопско изследване. За по-нататъшни експерименти са избрани само Грам положителни, неподвижни, пръчковидни бактерии, показващи фенотипни характеристики, подобни на видовете Lactobacillus върху специфични за вида MRS агарови среди (L. salivarius, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus, L. fermentum и L. acidophilus) (съставът на медиите не е даден тук). Основата за подбора беше, че тези изолати вероятно биха могли да принадлежат към род Lactobacillus, за който е доказано, че има пробиотични свойства [30].

Определяне на антибактериалната активност на избрана LAB чрез метод за дифузия на агарни кладенци

ин-витро

Маса 1: -Антибактериална активност на видовете LAB по отношение на ZOI, използвайки метода на дифузия на агарни кладенци.