Вирусология
Тази статия е част от изследователската тема
Нови и иновативни стратегии в разработването на антивирусни средства Вижте всички 13 статии
Редактиран от
Оливър Планц
Университет в Тюбинген, Германия
Прегледан от
Рави Джавери
Катедра по педиатрия, Медицинско училище във Файнберг, Северозападен университет, САЩ
Масая Сугияма
Национален център за глобално здраве и медицина, Япония
Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.
- Изтеглете статия
- Изтеглете PDF
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Допълнителни
Материал
- Цитат за износ
- EndNote
- Референтен мениджър
- Прост ТЕКСТ файл
- BibTex
СПОДЕЛИ НА
Оригинални изследвания СТАТИЯ
- 1 Ключова лаборатория по медицинска молекулярна вирусология, Училище за основни медицински науки и Национален клиничен изследователски център за стареене и медицина, болница Хуашан, Университет Фудан, Шанхай, Китай
- 2 Института по биомедицински науки, Шанхайски медицински колеж, Университет Фудан, Шанхай, Китай
- 3 Ключова лаборатория за градско земеделие (Юг), Министерство на земеделието, Училище по земеделие и биология, Шанхайски университет Jiao Tong, Шанхай, Китай
- 4 Лаборатория по невропсихофармакология, Колеж по фундаментална медицина, Шанхайски университет по медицина и здравни науки, Шанхай, Китай
- 5 Шанхайска ключова лаборатория по клинична гериатрична медицина, болница Huadong, Шанхай, Китай
Въведение
Вирусът на хепатит В (HBV) причинява преходни и хронични инфекции на черния дроб. Въпреки че ефективна превантивна ваксина се предлага от повече от 30 години, повече от 350 милиона индивиди по света все още имат CHB (Curtis et al., 2005). Хронично заразените индивиди са изложени на висок риск от цироза и хепатоцелуларен карцином (Buendia, 1992). Ваксината срещу HBV не предизвиква почти никакво производство на защитни антитела при пациенти с CHB (Trepo et al., 2014). Одобрените лечения за CHB на базата на интерферони (IFN) или NAs могат ефективно да намалят виремията на HBV. Нито една от тези монотерапии, нито тяхната комбинация не могат ефективно да намалят серумния HBsAg, което е надежден маркер за благоприятна дългосрочна прогноза (Европейска асоциация за черния дроб, 2012).
Клинично персистирането на HBsAg най-малко 6 месеца в гостоприемника е признак на хронична инфекция. HBsAg е необходим за образуване на HBV вириони и навлизане на хепатоцити и може също така да потисне имунния отговор на гостоприемника към HBV (Op den Brouw et al., 2009; Patient et al., 2009; Chan et al., 2011). Следователно се смята, че елиминирането на персистиращото излишно производство на антиген в серума нарушава имуносупресията. Положителността на HBsAg може да бъде асимптоматична или да доведе до прогресиращо активно чернодробно заболяване. При хроничен HBV персистиращото възпаление води до чернодробна цироза или хепатоцелуларен карцином при 25% от пациентите. (Michel et al., 2015). Понастоящем антигенемията на HBsAg се счита за нова цел на антивирусната терапия. Установено е, че редица съединения и техните производни функционират като специфични инхибитори на секрецията на HBsAg (Dougherty et al., 2007; Xu et al., 2014). Въпреки това, малко проучвания показват, че тези съединения оказват видни ефекти и обикновено водят до значителна цитотоксичност; Следователно, нито един специфичен инхибитор на секрецията на HBsAg не е подходящ за клинична употреба. Проучванията при животни обаче показват, че клевудинът намалява HBsAg, частично възстановява имунните отговори на гостоприемника и подобрява ефикасността на терапевтичните ваксини (Menne et al., 2002). Следователно трябва да бъдат идентифицирани нови агенти.
Въз основа на тези доказателства предположихме, че екстрактите от маруля, естествен източник на органични антиоксиданти, могат да намалят HBsAg и да инхибират репликацията на HBV чрез намаляване на нивата на вътреклетъчен излишък на ROS и промяна на вътреклетъчното редокс състояние. За да се провери тази хипотеза, ефектите на екстрактите от маруля върху секрецията на HBsAg и HBeAg, репликацията и транскрипцията на HBV бяха открити в три HBV-експресирани HepG2 клетъчни линии. Междувременно бяха оценени вътреклетъчните ROS и потенциалът на митохондриалната мембрана.
Това проучване демонстрира както екстракти от маруля, така и лутеолин-7-О-глюкозидът, който идентифицирахме като функционален компонент на екстрактите от маруля, упражнява мощни анти-HBV ефекти и ефективно намалява секрецията на HBsAg. Освен това предоставяме доказателства, че компонентите на марулята могат да упражняват синергичен анти-HBV ефект, когато се комбинират със съществуващите антивирусни лекарства IFNα-2b или NAs.
Материали и методи
Отглеждане на маруля
Марулята (cv. Lollo Rossa) се култивира хидропонно в оранжерия в Шанхайския университет Джао Тонг, Китай, както е описано по-рано (Yang et al., 2017) в хранителен разтвор (pH 5.8), съдържащ азотен тор като 9 mM NaNO3 (S11) или 9 mM глицин (S15) за 4 седмици. Всички листа се събират в края на култивирането, замразяват се в течност N и се замразяват при -80 ° С до по-нататъшен анализ.
Профилиране на метаболити на маруля
Екстрактите от маруля се приготвят, както е описано по-рано (Yang et al., 2017). Накратко, 0,2 g проби се смилат на прах в течен N, екстрахират се в 1 ml разтвор на метанол/вода (4: 1 v/v), обработват се с ултразвук в продължение на 30 минути при 25 ° C, инкубират се при 4 ° C за 12 h и се центрофугират на 12000 ж за 10 минути; Анализират се 0,5 ml супернатант. Профилирането на метаболитната салата се извършва с помощта на ултраефективна течна хроматография-йонна подвижност спектрометрия-квадруполно-време на полет мас-спектрометрия (UPLC-IMS-QTOF/MS, Waters Corp., Milford, MA, САЩ), както е описано от Yang et ал. (2017).
Клетъчна култура, плазмиди, лекарства и реактиви
Продуциращите HBV клетъчни линии HepG2.2.15, HepAD38 и родителските клетъчни линии HepG2, използвани за преходна трансфекция, се поддържат в DMEM, допълнена с 10% FBS, 2 mM L-глутамин, 100 IU. ml -1 пеницилин, 100 mg. ml -1 стрептомицин във влажна атмосфера с 5% CO2 при 37 ° C. DMEM, FBS, L-глутамин, пеницилин и стрептомицин са закупени от Gibco Life Technologies (Grand Island, NY, САЩ).
В нашата лаборатория е конструиран плазмид p1.3HBV, съдържащ крайно излишен (1,3-кратна дължина на HBV геном) репликационен HBV геном. Вектори-репортери на луцифераза, съдържащи регулаторни елементи на HBV (ENI/Xp, nt1237-1375; ENII/Cp, nt1648–1853; Sp1, nt2224–2784; Sp2, nt2814–3123), са конструирани, както е описано по-рано (Zhang et al., 2011). Рекомбинантен човешки IFNα-2b е закупен от Sino Biological Inc. (LuDong Area, BDA, Пекин). 3TC чистота (> 98%) е закупена от Sigma (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). NAC е закупен от Yeasen Biology Co., Ltd. (Шанхай, Китай).
Трансфекция на клетките
HepG2 клетки бяха засяти в 6-ямкови плаки с плътност от 10 6 клетки на гнездо и временно трансфектирани с 2 μg плазмидна ДНК, използвайки Fugene HD (Promega, Madison, WI, САЩ), следвайки инструкциите на производителя.
Лечение с екстракти от маруля и други антивирусни средства
Преди инвитро 0,5 ml екстракти от маруля бяха вакуумно лиофилизирани при 25 ° С и ресуспендирани в 200 μL вода. HepG2.2.15 клетки бяха засяти в 6-гнездни плаки с плътност 10 6 клетки на гнездо, култивирани в продължение на 24 часа, след това екстрактите от маруля, 3TC и/или IFNα-2b бяха добавени при концентрациите, посочени на фигурите. Медиите, съдържащи наркотици, се сменят на всеки 2 дни. Клетките се събират на ден 5 след посяването. За p1.3HBV-преходно трансфектирани HepG2 клетки, 10 6 клетки бяха засяти на кладенче, третирани и събрани след обработка от 96 часа.
Анализ CCK-8
Жизнеспособността на три клетъчни линии, които използвахме, беше определена с помощта на CCK8 анализ (Dojindo, Kumamoto, Япония). Клетките се засяват с плътност 5000 клетки на гнездо в 96-ямкови плаки, инкубират се в продължение на 24 часа, след което се обработват с различни концентрации на екстракти от маруля в продължение на 2 дни. Контролните ямки съдържаха еквивалентно количество среда. Всички лекувани групи имаха пет повторения. Регент CCK8 се добавя към всяка ямка, инкубира се в продължение на 1 час и стойностите на абсорбция се определят с помощта на четец за микроплаки (Bio-Rad, Hercules, CA, САЩ) при 450 nm.
Оценка на HBsAg, HBeAg и HBV DNA
Нивата на HBsAg и HBeAg в супернатантите на културата бяха оценени по полуколичествен начин, използвайки ELISA комплекти (Kehua, Шанхай, Китай) спрямо стандартна крива. Абсорбцията се измерва при 450 и 630 nm с помощта на четец за микроплаки (Bio-Rad). Първоначално стандартните криви бяха валидирани спрямо търговски количествени анализи (Adicon, Шанхай, Китай), извършени паралелно (допълнителна фигура S1G).
Вътреклетъчната HBV ДНК беше измерена по полуколичествен начин чрез Q-PCR на PCI система ABI 7500 в реално време (Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния, САЩ), използвайки SYBR Green QPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, United В съответствие с инструкциите на производителя. ДНК се определя количествено, като се използват специфични праймери: HBV-Core-F (5′-CCTTCTTACTCTACCGTTCC-3 ′), HBV-Core-R (5′-GACCAATTTATGCCTACAGCC-3 ′). Всички тестове се провеждат два пъти независимо, всеки в три повторения, когато се тества.
Откриване на южно петно на междинни продукти за репликация на HBV
Хибридизацията на Southern blot се използва за откриване на вътреклетъчен HBV RI и се извършва, както е описано по-рано (Bai et al., 2016). Анализът се провежда два пъти независимо.
РНК изолация и Q-PCR анализ с обратен транскрипт
Обща РНК беше изолирана от клетки, използвайки реагент TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ), съгласно протокола на производителя, и РНК беше използвана за синтез на кДНК от обща РНК от 40 ng с комплект PrimeScript RT (Takara, Shiga, Япония). Праймери HBV2270F (5′-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3 ′) и HBV2392R (5′-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3 ′) бяха използвани за HBV 3.5 kb транскрипти (123 bp фрагмент); HBV1805F (5′-TCACCAGCACCATGCAAC-3 ′) и HBV1896R (5′-AAGCCACCCAAGGCACAG-3 ′) са за общо HBV-специфични транскрипти (фрагмент от 92 bp). PCR в реално време се провежда чрез денатурация при 95 ° C за 30 s, последвано от 40 цикъла от 95 ° C денатурация за 3 s и 60 ° C отгряване/удължаване за 30 s, използвайки SYBR QPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, САЩ) на ABI 7500 PCR система в реално време. Анализите се провеждат два пъти независимо.
Северно петно на HBV РНК транскрипти
Хибридизацията на Northern blot се използва за откриване на вътреклетъчни транскрипти на HBV RNA, както е описано по-рано (Lin et al., 2017). Анализът се провежда два пъти независимо.
ROS анализи
Вътреклетъчните нива на супероксиден анион бяха измерени с помощта на DCFH-DA (Yeasen Biology Co., Ltd., Шанхай, Китай) чрез флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS). Производството на митохондриален супероксид в живите клетки се открива с помощта на анализа MitoSOX Red (Life Technologies, Grand Island, NY, САЩ) върху поточен цитометър FACScan (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, САЩ). Експериментите бяха повторени три пъти.
Измерване на потенциала на митохондриалната мембрана чрез лазерна сканираща конфокална микроскопия с помощта на Mitored
Клетките, култивирани при ниска плътност върху покрити с фибронектин 35-милиметрови съдове със стъклено дъно, се инкубират в продължение на 20 минути при 37 ° C с MitoRed сонда (Dojindo) за оценка на потенциала на митохондриалната мембрана и DAPI за локализиране на ядрата. Оцветените клетки се промиват с PBS и се изследват с помощта на лазерно сканиращ конфокален микроскоп (Leica, Wetzlar, Германия). Експериментите бяха повторени два пъти.
Измерване на потенциала на митохондриалната мембрана чрез FACS с помощта на JC-1
На 2 часа след третирането средата на клетъчната култура се отстранява, клетките се усвояват с трипсин и се приготвят едноклетъчни суспензии и се инкубират с багрило JC-1 (Yeasen Biology Co., Ltd., Шанхай, Китай) за 20 минути при 37 ° С на тъмно. Клетките се промиват с PBS и незабавно се анализират с помощта на поточен цитометър FACScan. Бяха изследвани общо 10 000 клетки; зелена флуоресценция се наблюдава с помощта на 529 nm филтър и оранжева флуоресценция с помощта на 590 nm филтър. Експериментите бяха повторени три пъти.
Резултати
Екстрактите от маруля потискат секрецията на антиген на HBV в клетки, експресиращи HBV
Ефектите на двата екстракта от маруля, култивирани от 9 mM NaNO3 (S11) и 9 mM глицин (S15) върху експресията на вирусни антигени бяха изследвани чрез измерване на скоростта на секреция на HBsAg и HBeAg от HBV-експресиращи клетки. И двата екстракта от маруля значително потискат секрецията на HBsAg и HBeAg в сравнение с контролните клетки на носителя (Фигури 1A, B, D, E, G, H). Максималната скорост на инхибиране на секрецията на HBsAg е 82,5% в клетките HepAD38.
ФИГУРА 1. Инхибиращ ефект на екстрактите от маруля върху експресията на HBsAg и HBeAg в клетки HepG2.2.15, клетки HpeAD38 и клетки HepG2, временно трансфектирани с репликационно компетентен HBV клон. Клетките се третират с две групи екстракти от маруля, хидропонно култивирани с различен източник на азот (S15, обработен с 9 тМ глицин и S11 със същата концентрация на нитрат) при посочените концентрации в продължение на 2 дни. Дозозависимо потискане на експресията на HBV антиген чрез екстракт от маруля в различни HBV клетъчни линии (A, B, D, E) и HepG2 клетки, временно трансфектирани с HBV (G, H). HBsAg и HBeAg се определят количествено, като се използва електрохимичен илюминисцентен имуноанализ. Анализът CCK8 се използва за определяне на цитотоксичния ефект на екстрактите от маруля в различни клетъчни линии (C, F, I). Всички стойности са изразени като проценти спрямо необработената контрола (Control). Статистическата значимост е изчислена с помощта на студент т-тест. Ns, не е значително, ∗ P ∗∗ P ∗∗∗ P ∗∗∗∗ P ∗ P ∗∗ P ∗∗∗ P ∗∗∗∗ P ∗ P ∗∗ P ∗∗∗ P ∗∗∗∗ P 2).
Освен това нивата на HBsAg и HBeAg в средата бяха определени след третиране с различни концентрации на лутеолин-7-О-глюкозид. И 10 mM NAC се използва като положителна контрола съгласно предишното проучване (Weiss et al., 1996). ELISA показа, че лутеолин-7-О-глюкозид ефективно намалява нивата както на HBsAg, така и на HBeAg в средата по зависим от дозата начин (Фигури 4В, С). Максималната степен на инхибиране на секрецията на HBsAg е 75%. Southern blot и north blot разкриха, че лутеолин-7-О-глюкозид инхибира репликацията и транскрипцията на HBV по дозозависим начин (Фигури 4D, F); количествените PCR анализи в реално време потвърждават тези резултати (Фигури 4Е, G). Максималните нива на инхибиране са съответно 51 и 44,7% за HBV ДНК и вирусна РНК.
Лутеолин-7-О-Глюкозидът от екстрактите от маруля може да инхибира HBV чрез промяна на вътреклетъчното редокс състояние и облекчаване на митохондриалната дисфункция
За изясняване на механизмите, отговорни за анти-HBV ефектите на екстрактите от маруля, бяха изследвани транскрипционните активности на четири HBV промотора в HepG2 клетки, като се използва двоен луциферазен репортерен анализ. Относителните активности на четирите HBV промотора (нормализирани към контролния репортер) са почти непроменени след третиране с екстракти (Фигура 5А). Този резултат предполага, че способността на екстрактите от маруля да намалят продукцията, репликацията и транскрипцията на вирусен антиген не са били силно свързани с регулирането надолу на промоторната активност на HBV.
Цитиране: Cui X-X, Yang X, Wang H-J, Rong X-Y, Jing S, Xie Y-H, Huang D-F и Zhao C (2017) Luteolin-7-О-Глюкозидът, присъстващ в марулените екстракти, инхибира производството на антиген на повърхностния хепатит В и вирусното размножаване от човешки хепатомни клетки инвитро. Отпред. Микробиол. 8: 2425. doi: 10.3389/fmicb.2017.02425
Получено: 14 септември 2017 г .; Приет: 23 ноември 2017 г .;
Публикувано: 06 декември 2017 г.
Оливер Планц, Университет Тюбинген, Германия
Масая Сугияма, Национален център за глобално здраве и медицина, Япония
Рави Джавери, болници на Университета на Северна Каролина, САЩ
† Тези автори са допринесли еднакво за тази работа.