Етнофармакология

Тази статия е част от изследователската тема

Лечебни растения за сърдечно-съдови и невродегенеративни заболявания, свързани със стареенето: от пейка до легло Вижте всички 20 статии

Редактиран от
Юхуа Сю

Университет за наука и технологии в Макао, Макао

Прегледан от
Бин Ген

Болница Фувай, Китайска академия за медицински науки и Медицински колеж Пекински съюз, Китай

Янфей Лю

Пекински университет по китайска медицина, Китай

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

ефект

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 болница Guang’anmen, Китайска академия за китайски медицински науки, Пекин, Китай
  • 2 болница Xiyuan, Китайска академия на китайските медицински науки, Пекин, Китай
  • 3 Пекински университет по китайска медицина, Пекин, Китай

Въведение

Атеросклерозата е общата патологична основа на много сърдечно-съдови заболявания (ССЗ). Въпреки че лекарствата за понижаване на липидите, интервенционалната терапия и други конвенционални лечения са широко използвани за намаляване на заплахите за човешкото здраве, атеросклерозата и свързаните с нея ССЗ са все още водещата причина за смърт в световен мащаб (Anderson et al., 1991; Vilahur et al., 2014). Атеросклерозата е придружена от дислипидемии, включително повишени нива на липопротеинов холестерол с ниска плътност (LDL-C), общ холестерол (TC), триглицериди (TG) и др. (Ju et al., 2018). Статините са първа линия фармакотерапия за дислипидемии и ефективно контролират нивата на липидите и намаляват основните неблагоприятни сърдечно-съдови събития (MACE) (Catapano et al., 2016; Kobiyama and Ley, 2018). Съобщава се обаче, че статините корелират с различни нежелани събития, свързани с миопатия, бъбречно заболяване, хепатобилиарни разстройства и други събития (Law и Rudnicka, 2006). В допълнение, атеросклерозата се счита за хронично възпалително заболяване на големите и средните артерии (Ross, 1999; Libby, 2002; Hansson, 2005), с промени в провъзпалителните цитокини, като фактор на туморна некроза-алфа (TNF-α ), интерлевкин (IL) -6 и IL-1β и противовъзпалителни цитокини, включително IL-10 (Tedgui and Mallat, 2006). Прегледана е ролята на тези цитокини в развитието, прогресията и усложненията на атеросклерозата (Tedgui and Mallat, 2006).

Изследвания през последното десетилетие показват, че чревната микробиота е свързана с определени човешки заболявания, включително затлъстяване (Boulange et al., 2016), диабет тип 2 (Qin et al., 2012), хиперхолестеролемия (Martinez et al., 2009) и ССЗ (Tang et al., 2017), всички от които са свързани с атеросклероза (Jonsson and Backhed, 2017). Ролята на чревната микробиота в атеросклерозата започна да се оценява през последните години, главно включително регулирането на възпалението и имунитета и метаболизма на холестерола и липидите от чревната микробиота и нейните метаболити (Jonsson and Backhed, 2017; Ma и Li, 2018) . Тези открития подчертават големите потенциални превантивни и терапевтични ползи за атеросклерозата, които могат да бъдат реализирани чрез насочване към чревния микробиом.

Берберинът (BBR) е изохинолинов алкалоид, който може да бъде изолиран от различни лечебни растения, като напр Coptis chinensis Франч и Кортекс фелодендри. BBR има различни биологични функции, включително противовъзпалителна активност, подобряване на нивата на холестерола и метаболизма на липидите и предотвратяване на метаболитни заболявания. Тези функции са много важни и при антиатеросклерозния ефект. Нутрицевтиците, съдържащи BBR, могат значително да намалят плазмените нива на LDL-C при пациенти с непоносимост към статини с хиперхолестеролемични пациенти (Marazzi et al., 2011). Друго проучване показва, че когато той плюс ниски дози статини и/или езетимиб, повечето пациенти с коронарна артериална болест (ИБС), които са с непоносимост към високи дози статини, могат да постигнат целеви нива на LDL-C в рамките на 3 до 6 месеца (Marazzi et al., 2019 ). Трябва да се отбележи, че терапевтичните ефекти на BBR върху тези възпалителни и метаболитни заболявания, като възникваща лека диария (Yue et al., 2019), улцерозен колит (Cui et al., 2018), затлъстяване (Xie et al., 2011; Zhang и др., 2015), хиперлипидемия (Wang et al., 2017) и диабет (Zhang et al., 2012), изглежда са свързани с регулирането на чревната микробиота.

Предишни проучвания показват, че антиатеросклеротичният ефект на BBR може да бъде свързан с промени в чревната микробиота, по-специално с повишеното изобилие на Акермансия, променено изобилие от Firmicutes и Verrucomicrobia и намален серумен триметиламин н-нива на оксид (TMAO) (Zhu et al., 2018; Shi et al., 2018). Въпреки това, специфичната връзка на ролята на BBR в чревната микробиота с атеросклероза и потенциалния механизъм все още са неизвестни. Следователно, ние изследвахме корелацията на ефекта на BBR (високи и ниски дози) върху чревната микробиота с облекчаването на атеросклерозата, включително подобрения в областта на плаката, нивата на серумните липиди и системното възпаление. Резултатите от секвенирането на 16S рРНК и метагеномния анализ показват, че антиатеросклеротичният ефект на високите и ниски дози BBR може отчасти да се дължи на промените в състава и функциите на чревната микробиота, които могат да бъдат свързани с противовъзпалителния и метаболизма на глюкоза и липиди.

Материали и методи

Модел на животни

Анализ на лезията на плаката

Сърдечните тъкани, съдържащи аортната дъга, се изрязват от проксималния аортен корен до клона на илиачната артерия и се поставят в 4% параформалдехидна среда за 6 часа. Зоната на атеросклеротична лезия на аортата беше оценена чрез en face Маслено червено O оцветяване, както е описано по-рано (Shi et al., 2018). Измерването на размера на лезията се основава на оцветяване на хематоксилин и еозин на участъци от парафинови аортни корени. Площта и размерът на лезията бяха анализирани от сляп наблюдател с помощта на софтуера Image J.

Измерване на серумни липидни профили

Взети са кръвни проби от ретро-орбиталния сплит след гладуване през нощта и са центрофугирани и серумът е съхранен незабавно при -80 ° C. Измервания на нивата на TC, TG, LDL-C, липопротеинов холестерол с висока плътност (HDL-C), много LDL-C (VLDL-C), липопротеин (a) [Lp (a)], Apolipoprotein B100 (ApoB100) и Аполипопротеин А-1 (APOA-1) са направени с помощта на ензимни методи в модел AD2700 автоматизиран биохимичен анализатор (Olympus, Токио, Япония).

Измерване на възпалителни цитокини

Нивата на серумни възпалителни цитокини, включително TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 и адипонектин (ADPN), бяха измервани с помощта на ELISA комплекти (Abcam, Cambridge, United Kingdom) в съответствие с инструкциите на производителя. Нивото на високочувствителен С-реактивен протеин (Hs-CRP) е измерено чрез нефелометричен имуноанализ.

Екстракция на фекална ДНК и PCR усилване

Секвениране с висока производителност и анализ на биоинформатиката

USEARCH (Edgar, 2010), QIIME v.1.9.1 (Caporaso et al., 2010) и VSEARCH (Rognes et al., 2016) са използвани за обработка на 16S rRNA генната последователност. Сдвоените четения на Illumina бяха контролирани от FastQC v.0.11.5 (Andrews, 2010), а USEARCH беше използван за присъединяване към сдвоените четения и преименуване. Бяха извършени премахване на баркодове и грундове, както и филтър за качество и бяха премахнати четенията без излишък. Всички 16S рРНК химерни последователности бяха открити и отстранени с помощта на алгоритъма UCHIME срещу базата данни RDP Gold (Edgar, 2013). Нехимерните последователности бяха сортирани по изобилие и групирани в оперативни таксономични единици (OTU), използвайки алгоритъма UNOISE (праг на 100% сходство) с отстранени ниско обилни последователности (осем последователности). Таблицата OTU е създадена с помощта на софтуер VSEARCH и представителната последователност на всяка OTU е класифицирана чрез алгоритъм RDP класификатор спрямо базата данни SILVA128 с праг на доверие 70%.

Изграждане на библиотеки и метагеномично секвениране

Квалифицираният екстракт от ДНК е разбит до среден фрагмент с размер от 300 bp приблизително с Covaris S220 (Covaris, Inc., MS, САЩ) за изграждане на сдвоена библиотека чрез NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (NEB, Пекин, Китай ). Секвенирането на сдвоени краища беше проведено на Illumina HiSeq4000 (Illumina Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ), използвайки HiSeq 4000 Reagent Kits v2 съгласно инструкциите на производителя.

Контрол на качеството на последователността и сглобяване на генома

SeqPrep 2 беше използван за разделяне на последователностите на адаптера от 3 ′ и 5 ′ края на сдвоени четения. Нискокачествените показания с недостатъчна дължина или стойност на качеството бяха елиминирани със Sickle 3. Четенията бяха подравнени към последователностите на ДНК на гостоприемника, използвайки BWA 4, който премахва замърсените четения с голямо сходство на подравняване. MEGAHIT (Li et al., 2015) беше използван за събиране на метагеномичните данни, а contigs с дължина над 300 bp бяха използвани като окончателен сглобен резултат.

Генна прогноза, таксономия и функционална анотация

MetaGene (Noguchi et al., 2006) беше използван за прогнозиране на отворени рамки за четене (ORF) на сглобените контиги. Прогнозираните ORF с дължина над 100 bp бяха преобразувани в аминокиселинни последователности съгласно таблицата за преводи на Националния център за биотехнологична информация.

Всички предсказани гени са групирани с помощта на CD-HIT (Fu et al., 2012) (параметри: 95% идентичност, 90% покритие). Представителните последователности бяха избрани от най-дългите последователности във всеки клъстер, за да се изгради нередудентният генен каталог. SOAPaligner (Li et al., 2008) е използван за картографиране на отчитанията след контрол на качеството в нередудентния генен каталог с 95% идентичност и е оценено изобилието на гени в съответните проби.

Нередудентните представителни последователности на генния каталог бяха подравнени към базата данни NCBI NR (отрязване на e-стойността на 1e –5) чрез BLASTP (Версия 2.2.28 +) (Altschul et al., 1997) и допълнително получени таксономични анотации. BLASTP срещу базата данни на Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) беше извършена за определяне на анотацията KEGG. KOBAS 2.0 е използван за функционална анотация въз основа на резултатите от сравнението.

Статистически анализи

Данните са изразени като средна стойност ± SEM. Част от 16S рРНК анализа беше извършен в R софтуер. В допълнение, диференцираните нива на атеросклеротични плаки, липиди, възпалителни цитокини и изобилието от потенциални чревни биомаркери на ниво род бяха тествани с помощта на еднопосочен вариационен анализ (ANOVA), последван от теста за множество сравнения на Sidak. Тестът за сумата на ранга на Крускал-Уолис е използван за тестване на диференциално изобилие от функционални родови и KEGG пътища. A стр-стойност ∗∗∗ стр ## стр ### стр 0,05) (Фигура 2).

Фигура 2. Берберинът подобрява серумните нива на липидите при ApoE -/- мишки, хранени с HFD. (А) Общ холестерол, (Б) триглицериди, (° С) липопротеинов холестерол с ниска плътност, (Д) липопротеин с висока плътност холестерол, (E) липопротеинов холестерол с много ниска плътност, (F) липопротеин (а), (G) Аполипопротеин В100 и (H) Аполипопротеин А-1. Данните са изразени като средно ± SEM (н = 12). Различията между групите бяха оценени чрез еднопосочна ANOVA. ∗ стр ∗∗ стр ∗∗∗ стр # стр ## стр ### стр 0,05). Освен това нивата на тези възпалителни цитокини се различават значително между високите и ниските групи (стр 0,05) (Фигура 3).

Фигура 3. Берберинът подобрява системното възпаление. (A-F) Серумни нива на TNF-α, IL-1β, IL-6, Hs-CRP, IL-10 и ADPN. Данните са изразени като средно ± SEM (н = 12). Различията между групите бяха оценени чрез еднопосочна ANOVA. ∗ стр ∗∗∗ стр # стр ### стр 8) и небактериални последователности (като митохондрии), бяха получени 1085 OTU със средно 25 801 последователности на проба (диапазон: 21,577-46 467), което представлява 75,3% от общите последователности.

Таблицата OTU беше нормализирана до минималния брой четения (21 577) на проба и след това беше извършено сравнение на разнообразието. Анализът на алфа разнообразието не разкрива значителна разлика в разнообразието на чревната микробиота между всяка група въз основа на индексите Chao 1 и Shannon (стр > 0,05) (Фигури 4А, В). PCoA, базиран на разстоянието на Bray Curtis, беше използван, за да се визуализира различието в състава на бактериалните съобщества. Композиционната структура на общността се различава в четирите групи, сред които групите High и Model и групите Low и Model са значително различни (стр ∗ стр ∗∗ стр 0,2%. Общо бяха избрани 116 бактериални OTU и всички представителни последователности бяха използвани за направата на дърво ML (допълнителна фигура S1). Има 116 OTU, коментирани на ниво род, с цветови диапазони, идентифициращи типа, към който принадлежат OTU. Тези OTU се разпространяват главно във вид на Firmicutes и Bacteroidetes и Lachnospiraceae_NK4A136_group и неназначен род. Heatmap е използван за анотиране на относителното изобилие на OTU, а OTU с по-голямо количество са разпределени главно в Алобакулум, Бацил, Lachnospiraceae_NK4A136_group, Блаутия, и т.н. Най-външният слой е добавен с анотация на кръг на ниво семейство.

Фигура 7. (А) LEfSe анализ на сравнения на пътища KEGG на нива 1 (LDA> 2,5, P 0,05). Бутиратът се получава чрез кондензация на две ацетил-КоА молекули и след това редукция до бутирил-КоА, който впоследствие се превръща в бутират по класическия път (Koh et al., 2016). Наблюдавано е, че ацетил-КоА хидролазата (K01067) е по-обогатена в моделната група в сравнение с високата доза (стр ### стр 0,05, фигури 9C, D).

Фигура 9. Разлики в изобилието в специфични чревни микробни KO за производство на TMAO. ** стр # стр -/- мишки. Наблюдавахме промените в серумните нива на липидни и възпалителни цитокини, както и структурата на състава и функциите на чревната микробиота след лечение с различни дози BBR, и корелирахме тези промени с атеросклерозата. Лечението с BBR отслабва атеросклерозата, индуцирана от HFD, намалява атеросклеротичните плаки и зони на лезии и подобрява нивото на серумните липиди и възпалителните цитокини. Ефектите от високата доза BBR са по-значими от ефектите от ниската доза. Последователността на 16S rRNA ампликони показа, че BBR значително променя композиционната структура на общността на чревната микробиота и различните дози BBR показват различни промени. По-нататъшен анализ на фактора на околната среда и метагеномната функция показва ефектите на BBR върху възпалението, метаболизма на глюкозата и липидите и производството на TMAO в чревната микробиота.

Повишените липидни нива са основен рисков фактор за атеросклеротични ССЗ. Тъй като Kong et al. (2004) идентифицират BBR като ново лекарство за понижаване на холестерола (Kong et al., 2004), терапевтичният ефект на BBR върху дислипидемия е потвърден и допълнително изследван през последните години (Kong et al., 2008; Zhang et al., 2008). Проучвания, проведени при пациенти с дислипидемия и мишки с хиперлипидемия, показват, че BBR значително намалява серумните нива на TC, TG и LDL-C (Kong et al., 2004; Zhang et al., 2008). В допълнение, тези резултати бяха подкрепени от два мета-анализа (Lan et al., 2015; Ju et al., 2018), които също съобщават за повишени нива на HDL-C след лечение с BBR. Настоящите резултати показват, че както високите, така и ниските дози BBR значително намаляват нивата на TC, APOB100 и VLDL-C, докато нивата на TG, HDL-C, LDL-C и LP (a) са намалени само в групата High. Нашите резултати не показват увеличение на HDL-C след лечение с BBR. APOA-1 има антиатерогенен ефект и инжектирането на APOA-1 може да намали вътреклетъчните нива на холестерол при ApoE -/- мишки (Pourcet and Staels, 2016; Gaddis et al., 2018). Въпреки това, няма значително увеличение на намалените нива на APOA-1 при атеросклерозни мишки, използващи високата или ниската доза BBR в нашето проучване.

Нашето проучване има някои ограничения. Предвид факта, че количеството на пробата е относително малко, убедителността на резултатите е ограничена. Въпреки че обяснихме връзката между регулаторния ефект на BBR върху чревната микробиота и намаляването на атеросклерозата въз основа на секвениране на 16S рРНК и метагеномния анализ, все още са необходими допълнителни експерименти за пренос на фекални бактерии, за да се изясни пряката връзка на BBR върху чревната микробиота с атеросклероза. Това проучване е проведено при ApoE -/- мишки, хранени с HFD. В бъдещото проучване трябва да разширим обхвата на пациентите с клинична атеросклероза, за да проучим добре връзката на ефекта на BBR върху чревната микробиота и атеросклерозата.

Заключение

В заключение, както високите, така и ниските дози BBR могат да подобрят нивата на серумните липиди и възпаление и да облекчат атеросклерозата при миши модел на HFD-индуцирана атеросклероза. Този антиатеросклеротичен ефект на BBR може отчасти да се дължи на промени в състава и функциите на чревната микробиота, които могат да бъдат свързани с противовъзпалителната активност и метаболизма на глюкозата и липидите. В допълнение, различните дози BBR имат различни ефекти, сред които затихването на атеросклерозата е по-очевидно при високата доза BBR, но промените в състава и функциите на чревната микробиота показват различна чувствителност към дозата на BBR.

Декларация за наличност на данни

Наборите от данни, генерирани за това проучване, могат да бъдат намерени в базата данни Sequences Read Archive в NCBI под номер за присъединяване PRJNA579048.

Декларация за етика

Изследването върху животни е прегледано и одобрено от Комитета за разследване на животните от Пекинския университет.