Етнофармакология

Тази статия е част от изследователската тема

Системна фармакология и традиционна китайска медицина Вижте всички 19 статии

Редактиран от
Aiping Lu

Хонконгски баптистки университет, Хонг Конг

Прегледан от
Джианбо Уан

Университет в Макао, Китай

Янфанг Женг

Университет по традиционна китайска медицина Фуджиан, Китай

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

медицина

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Фармацевтичен информатичен институт, Колеж по фармацевтични науки, Университет Zhejiang, Ханджоу, Китай
  • 2 Ключова лаборатория по микробна технология и биоинформатика от провинция Zhejiang, Институт по микробиология Zhejiang, Ханджоу, Китай
  • 3 NMPA Ключова лаборатория за тестване и предупреждение за риск във фармацевтичната микробиология, Институт по микробиология в Джъдзян, Ханджоу, Китай
  • 4 Изследователски институт за хронични заболявания, Катедра по хранене и хигиена на храните, Училище за обществено здраве, Медицински факултет на Университета Zhejiang, Хангжу, Китай
  • 5 Училище за обществено здраве, Медицински факултет на Университета Zhejiang, Ханджоу, Китай
  • 6 Колеж по предклинична медицина, Китайски медицински университет в Zhejiang, Ханджоу, Китай
  • 7 Технически център, Chiatai Qingchunbao Pharmaceutical Co. Ltd, Ханджоу, Китай

Въведение

Определено като болестно състояние, свързано с различни здравословни проблеми и намалена продължителност на живота (Hoyt et al., 2014), затлъстяването се превърна в сериозен здравословен проблем през последните десетилетия (James, 2008). Изчислено е, че повече от 1 милиард души са склонни към затлъстяване до 2030 г. по света (Kelly et al., 2008). Поради натрупването на мастна тъкан, затлъстелите индивиди изглеждат податливи на метаболитни нарушения, включително инсулинова резистентност, диабет тип 2, мастни чернодробни заболявания и сърдечно-съдови заболявания (Kopelman, 2000). Към днешна дата все още липсват обещаващи стратегии за профилактика и лечение на затлъстяването, отчасти поради ограниченото разбиране на механизмите, контролиращи появата на затлъстяване и развитието на свързаните с него метаболитни заболявания.

Сред сложните екологични и генетични фактори чревната микробиота играе критична роля в регулирането на затлъстяването, предизвикано от HFD и свързаните със затлъстяването метаболитни заболявания (Turnbaugh et al., 2006; Cani et al., 2009; Ridaura et al., 2013). Приема се, че диетата има приблизително 57% влияние върху структурата на микробиотата на червата, докато генетичните фактори имат приблизително 12% (Tomasello et al., 2014). В съответствие с уликите, че появата на затлъстял фенотип е свързана с микробиоза на червата, характеризираща се с по-богато изобилие от Firmicutes и по-бедни Bacteroides при генетични затлъстели ob/ob мишки (Ley et al., 2005) и че трансплантацията на чревна микробиота на човешки затлъстели близнаци в мишки, хранени с диета с ниско съдържание на мазнини, водят до фенотипи на трансмисивно затлъстяване (Ridaura et al., 2013), насочването към структурата и функцията на чревната микробиота може да бъде обещаваща стратегия за профилактика и лечение срещу затлъстяване.

Чревната микробиота влияе върху усвояването на хранителни вещества, събирането на енергия и метаболитните пътища на гостоприемника (Devaraj et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013). В сценария на затлъстяването нарушенията на метаболизма на липидите, въглехидратите, жлъчните киселини и аминокиселините са вероятно свързани с промени в състава на чревната микробиота (Caesar et al., 2010; Yokota et al., 2012; Devaraj et al., 2013; Neis et al., 2015). Изследването на фекалната метаболомика, особено нейната връзка с функционалното отчитане на чревния микробиом, е от голямо значение за разбирането на взаимодействията между диета и микробиота и метаболизма (Cheng et al., 2018; Zierer et al., 2018).

Материали и методи

Подготовка на KSLP

KSLP (Разрешение за лекарства за лекарства № B20021021) е получено от Chiatai Qingchunbao Pharmaceutical Co. Ltd. (Хангжу, Китай). Съставен от шест билки, включително R. glutinosa (Gaertn.) DC., П. женшен C.A.Мей., A. cochinchinensis (Lour.) Merr., O. japonicus (Thunb.) Ker Gawl., L. chinense Мил. И P. cocos (Шв.) Вълк. със смесеното съотношение на съответното съединение 409: 167: 26: 26: 26: 77, приготвянето на KSLP се следва, както е описано в патента (CN 1943707 B) (Zhou, 2012). Резултатите от HPLC отпечатъци от три различни партиди (партида 20171020, 20180302 и 20180716) бяха изброени (допълнителна фигура 1). В настоящото проучване KSLP (партида 20171020) се разтваря във вода Milli-Q и се приготвя като ресуспендиране на лекарството преди употреба.

Животни и експериментален дизайн

Мишки C57/BL6 (мъжки, 6-8 седмици) са закупени от Shanghai ReMed Biotechnology Co. Ltd. (Шанхай, Китай, www.remed-bio.com) и се поддържат при следната среда: 24-26 ° C, 40 –60% влажност, 12-часов цикъл светлина/тъмнина, храна и вода ad libitum. Всички експерименти с животни са проведени в център на провинция Zhejiang за контрол и превенция на заболяванията. Беше спазено Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни (Mason and Matthews, 2012).

Мишките бяха разделени на четири групи: нормална диета (ND, н = 5), нормална диета, доставена с KSLP (ND_K, н = 5), диета с високо съдържание на мазнини (HFD, н = 9) и HFD, доставени с KSLP (HFD_K, н = 9). Нормалната диетична храна е доставена от експерименталния център за животни в Zhejiang и прилагането на стандарта е GB14924.1-2001. Фуражът с HFD се доставя от Research Diets (New Brunswick, NJ, USA), като съотношението на енергийните доставки е 60% мазнини, 20% протеини и 20% въглехидрати. Мишките бяха снабдени или с KSLP ресуспендиране при 0,45 g/kg/ден, или със същото количество вода чрез интрагастрално приложение, съответно 12 последователни седмици.

Всяка седмица се измерва телесното тегло на мишките и приема на храна. На 9-та седмица от експерименталния период е извършен орален тест за глюкозен толеранс (OGTT). В края на експеримента мишките са гладували в продължение на 4 часа преди събирането на очната кръв. След това се събират проби от мишки за по-нататъшни изследвания. По-подробно, проби от висцерална мастна тъкан (ДДС, включително епидидимална мастна, периренална мастна и мезентериална мастна), подкожна мастна тъкан (SAT), интерскапуларна кафява мастна тъкан (НДНТ) и гастрокнемиални мускули бяха извлечени за претегляне; чревни изпражнения се събират и съхраняват при -80 ° C, докато се изпратят за 16S rRNA генно секвениране и нецелеви метаболомични анализи.

Тест за биохимия на кръвта

Кръвните проби се държат неподвижни в продължение на 2 часа, преди да се центрофугират при 3000 об/мин в продължение на 15 минути при 4 ° С. След центрофугиране супернатантите се събират за биохимичен тест на кръвта. Параметри, включително триглицериди (TG), общ холестерол (CHOL), липопротеин с ниска плътност (LDL), липопротеин с висока плътност (HDL) и глюкоза бяха анализирани на автоматичен биохимичен анализатор Hitachi 7180 (Киото, Япония).

За OGTT, мишките са гладували в продължение на 4 часа, преди да бъдат приложени интрагастрално с глюкозен разтвор в доза от 2,5 g/kg. На изходно ниво (0 минути), 30, 60 и 120 минути след прилагане на глюкоза, се събира кръвна опашка за измерване на нивото на глюкозата (Super glucocard II GT-1640, ARKRAY Factory, Inc., Киото, Япония). Създадена е крива на глюкозата и площта под кривата на глюкозата (AUC) се изчислява по формулата: AUC = (FPG/2 + 60 минути PG + 120 минути PG/2) × 1 h mmol · h/L (FPG: плазмена глюкоза на гладно).

Последователност на чревната микробиота и анализ на данни

Части от фекални проби бяха изпратени до Zhejiang Tianke high-tech Co., Ltd (Ханджоу, Китай. Http://www.tkgeneclub.com/tkgeneclub/index.html) за 16S rRNA генно секвениране. Общо геномна ДНК беше извлечена от 0,25 g фекалии с помощта на PowerSoil ® DNA Isolation Kit (MO BIO, Cat. No. 12888, Carlsbad, CA, USA) съгласно протоколите на производителя. Концентрацията и чистотата на ДНК се наблюдават върху 1% агарозни гелове. Според концентрацията ДНК се разрежда до 1 ng/μl с помощта на стерилна вода. 16S рРНК гени бяха амплифицирани с помощта на специфичен праймер (16S V3 – V4: 341F-806R) с баркода. Всички PCR реакции бяха проведени с KAPA HiFi ™ HotStart ReadyMix (2 ×). PCR продуктът се потвърждава чрез използване на 1% електрофореза в агарозен гел. Амплифицираните продукти се пречистват с Beckman DNA Beads и се определят количествено чрез флуорометър Qubit 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Библиотеката се разрежда до 60 рМ. Обогатената библиотека беше заредена в Ion 530 ™ Chip и секвенирана на платформа Ion S5 ™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и бяха генерирани около 500 bp единични четения. Данните за сурово секвениране са налични в базата данни Sequence Read Archive (SRA) на NCBI и са свързани с биопроект PRJNA565488.

Анализ на генната експресия

Експресията на Akkermansia беше допълнително анализирана с помощта на qPCR в реално време, както е описано другаде (Everard et al., 2013). Праймерите бяха поръчани от Sangon Biotech (Шанхай, Китай) и 16S rDNA беше амплифицирана като ендогенен референтен ген. Относителният израз се изчислява с метода ΔΔCT и се изразява като промяна в пъти в сравнение с контролата (група ND).

Нецелево изследване на метаболомиката

Части от фекални проби бяха изпратени на Metabolon в сътрудничество с Calibra Diagnostics, Ltd. (Хангжу, Китай, www.metabolon.com) за нецелево метаболомично проучване. Накратко, приблизително 50 mg изпражнения бяха лиофилизирани в сушилня за замразяване (FreeZone 2.5L, LABCONCO, Kansas City, MO, USA) за 8 часа. След това пробите бяха подложени на система MicroLab STAR ® (Хамилтън, Швейцария) за автоматична обработка, която включва филтриране, добавяне на метанол към утайка на протеин и центрофугиране, преди супернатантът на всяка проба да бъде прехвърлен в система за изпаряване TurboVap ® II за органичен разтворител отстраняване и разтваряне на подвижна фаза.

Течна хроматография с ултрависока производителност - тандемна масова спектроскопия (UPLC-MS/MS): Всички методи са използвали свръхпроизводителна течна хроматография Waters Acquity и Thermo Scientific Q-Exactive с висока разделителна способност/точен масспектрометър, свързан с нагрята електроспрей йонизация (HESI-II) източник и анализатор на масата Orbitrap работят при 35 000 масови разделителни способности. Конкретните условия на UPLC и MS, както и валидирането на метода са описани подробно в предишни статии (Long et al., 2017).

Статистически анализ

Данните са представени като средно ± стандартни грешки на средните стойности (S.E.M.). Статистическите разлики бяха оценени в две групи чрез дисперсионен анализ (ANOVA), използвайки софтуера GraphPad Prism 7.0. При изследванията на метаболомиката се извършват статистически анализи в ArrayStudio; Студентски т тестът е извършен между две групи, докато ANOVA е използван сред над две групи. A стр стойност по-малка от 0,05 показва статистическа значимост. Анализът на корелацията на Pearson беше извършен с помощта на SPSS и съответната топлинна карта беше визуализирана с помощта на Excel и Adobe Illustrator.

Резултати

KSLP Намалено телесно тегло, съотношение на бялата мастна тъкан и подобрено нарушение на толерантността към глюкоза при HFD мишки

маса 1 Нивата на серумните липиди и глюкоза в четири групи.

Фигура 2 KSLP реконструира чревната микробиотна общност при HFD мишки. (А) Анализ на кривата на разреждане. Абсцисата е броят на последователностите, произволно извлечени от проба, а ординатата е броят на OTU, които могат да бъдат конструирани въз основа на броя на секвенционните числа. (Б) Графиките бяха генерирани с помощта на анализ на основните координати (PCoA).

Таблица 2 Ефектите на HFD и KSLP върху разнообразието на чревната микробиота.

Базираната на UniFrac PCoA беше оценена, за да се сравни общата структура на микробиотата за всяка група (Фигура 2В). Докато ND и ND_K клъстерите се обединиха в един, се появиха отделни клъстери за групи ND/ND_K, HFD и HFD_K. Този резултат предполага, че KSLP е променил цялостния състав на микробиотата на червата при HFD мишки, но няма ефект върху ND мишки.

Регулирана чревна микробиота на KSLP при типове и семейни нива при HFD мишки

Фигура 6 Ключови филотипове, отговарящи на лечението с KSLP при HFD мишки. (А) Резултатите за линеен дискриминантен анализ (LDA) бяха изчислени за таксони с диференциално изобилие във фекалната микробиота на ND (лилаво), ND_K (червено), HFD (зелено) и HFD_K (жълто) мишки. Резултатът от LDA показва размера на ефекта и класирането на всеки различно обилен таксон (LDA> 4). (Б) QPCR анализ в реално време. Относителният израз на Akkermansia се изразява като промяна на гънките в сравнение с групата на ND.

Регулирана от затлъстяването чревна микробиота на KSLP

Тъй като идентифицирахме 27 рода, които имаха значителни промени в изобилието между ND и HFD групи, корелацията между тези 27 рода и свързаните със затлъстяването параметри беше изчислена чрез корелационен анализ на Pearson. Резултатът е обобщен в допълнителна таблица 2 и е представен като топлинна карта (Фигура 7). Като цяло има девет рода, тясно свързани с фенотипа на затлъстяването, от които са идентифицирани силни положителни взаимовръзки Интестинимонас, Oscillibacter, Лактококи, Christensenellaceae_R-7_group и Aliihoeflea, докато са установени значителни отрицателни взаимовръзки за Ruminococcaceae_UCG-014, Prevotellaceae_UCG-001, Мурибакулум, и Family_XIII_AD3011_group (Фигура 7). От тези девет рода, Интестинимонас, Oscillibacter, Christensenellaceae_R-7_group и Aliihoeflea може да се обърне от KSLP при HFD мишки (Фигура 5С). Следователно, Интестинимонас, Oscillibacter, Christensenellaceae_R-7_group и Aliihoeflea може да са цели за намеса за KSLP при HFD мишки.

Фигура 8 Различни метаболити сред три групи. (А) Брой на регулирани и понижени метаболити. (Б) Влияещ фактор на метаболитите, използващи двупосочна ANOVA.

KSLP регулирани поколения, свързани със затлъстяването, заедно с техните корелирани метаболити

Специално внимание беше отделено на разкриването на новата вътрешна връзка между идентифицираната свързана със затлъстяването чревна микробиота и обърнатите метаболити в отговор на KSLP при HFD мишки. В тази връзка направихме корелационен анализ, като приложихме четирите идентифицирани KSLP-отговорни-свързани със затлъстяването родове на Интестинимонас, Oscillibacter, Christensenellaceae_R-7_group и Aliihoeflea, както и 22-те свързани с KSLP-свързани с HFD метаболити (допълнителна таблица 6).

Както е посочено в топлинната карта (Фигура 9), Интестинимонас, Oscillibacter, и Christensenellaceae_R-7_group показаха много сходни модели на взаимоотношения на метаболитите, които положително корелираха с хистидилаланин, фенилаланилглицин и гама-CEHC, но отрицателно корелираха с н-метилаланин, н,н,н-триметил-5-аминовалерат, (12 или 13) -метилмиристат (a15: 0 или i15: 0), 2-хидроксиарахидат *, 2-хидроксибехенат, 2-хидроксилигноцерат *, 3-кетосфинганин, ланостерол, стигмастадиенон, 2′-дезоксиинозин, N6-метиладенозин, 2′-дезоксигуанозин, 5,6-дихидроуридин и хидроксиметилпиримидин. Що се отнася до Aliihoeflea, той показа слаба корелация с метаболитите в списъка, с изключение на отрицателните взаимовръзки с (12 или 13) -метилмиристат (a15: 0 или i15: 0) и 3-кетосфинганин.

Фигура 9 Корелацията между родовете, свързани с KSLP, отговорни за затлъстяването, и обърнатите метаболити от KSLP. ** |r| > 0,5 и стр Ключови думи: Традиционна китайска медицина, диета с високо съдържание на мазнини, затлъстяване, чревна микробиота, фекална нецелена метаболомика, корелационен анализ

Цитиране: Gong S, Ye T, Wang M, Wang M, Li Y, Ma L, Yang Y, Wang Y, Zhao X, Liu L, Yang M, Chen H и Qian J (2020) Формула на традиционната китайска медицина Кан Шуай Лао Пиан Подобрява затлъстяването, дисбиозата на червата и метаболитните нарушения при фекалии с високо съдържание на мазнини. Отпред. Pharmacol. 11: 297. doi: 10.3389/fphar.2020.00297

Получено: 19 ноември 2019 г .; Приет: 27 февруари 2020 г .;
Публикувано: 25 март 2020 г.

Айпинг Лу, Хонконгски баптистки университет, Хонконг

Янфанг Джън, Университет по традиционна китайска медицина Фуджиан, Китай
Jianbo Wan, Университет в Макао, Китай